埃博霉素B高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化

龔國利， 王 娜， 劉麗麗

（陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安710021）

埃博霉素（Epothilones）是粘細菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類次級代謝產(chǎn)物[1-2]，是一種新型的抗腫瘤藥物。其作用機制與紫杉醇相同，通過促微管聚合作用從而抑制腫瘤細胞的增殖[3-4]，并且與紫杉醇相比，埃博霉素具有毒性更小，水溶性更好[5]，對耐藥性細胞作用更強，抗腫瘤譜更廣等優(yōu)點，因此埃博霉素被譽為最具有潛力的抗腫瘤新藥之一。

然而埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量很低造成埃博霉素類藥物生產(chǎn)成本很高。為了提高埃博霉素的產(chǎn)量，可進行產(chǎn)物的異源表達以及生產(chǎn)菌株的選育。已有文獻[6-8]報道埃博霉素的異源表達已獲得成功，但是由于其對宿主細胞的毒害作用，使得產(chǎn)量并沒有提高，反而大幅度下降，所以通過天然產(chǎn)生菌株選育來獲得埃博霉素高產(chǎn)菌株仍然是最有效的方法。

Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面分析法是20世紀(jì)中后期發(fā)展起來的優(yōu)化試驗條件的統(tǒng)計學(xué)方法，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵條工藝的優(yōu)化[9-11]。作者以纖維堆囊菌SoF5-76為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變，成功獲得一株埃博霉素B高產(chǎn)菌株SoF5-H23，并進一步通過統(tǒng)計學(xué)方法對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 纖維堆囊菌SoF5-76（Sorangium cellulosum So F5-76）：作者所在實驗室保存菌。由作者所在實驗室從土壤中篩選，經(jīng)過基因組重組技術(shù)選育獲得。經(jīng)過后期發(fā)酵工藝優(yōu)化埃博霉素B產(chǎn)量可達到35.24 mg/L。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）CNST 培 養(yǎng) 基 ：KNO30.05 g/dL，Na2HPO40.025 g/dL，MgSO4·7H2O 0.1 g/dL，F(xiàn)eCl30.001 g/dL，瓊脂2 g/dL，微量元素液 1 ml/L，pH 7.2。121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

2）M26培養(yǎng)基：土豆淀粉8.0 g/L，大豆蛋白胨2.0 g/L，葡萄糖 2.0 g/L，酵母粉 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl21.0g/L，EDTA-Fe3+1 mL/L， 微量元素1 mL/L，以KOH調(diào)節(jié)pH值為 7.2。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉3.9 g/L，脫脂奶粉2.2 g/L，無水氯化鈣1.3 g/L，葡萄糖1 g/L，豆餅粉1.5 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，EDTA-Fe3+3 mL/L， 微量元素0.5 mL/L，pH 7.4，樹脂XAD-16 2%。115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 Waters-2487-2420-1525高效液相色譜儀：美國waters公司；YXJ-2高速電動離心機：金壇市精達儀器制造廠；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安儀器設(shè)備有限公司；HWS型恒溫恒濕箱：金壇市精達儀器制造廠；SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造廠；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；磁力攪拌器：北京醫(yī)用離心機場；UV手提式殺菌燈：蘇凈集團安泰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變處理

1）紫外誘變：取培養(yǎng)了36～48 h的M26培養(yǎng)物，離心，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2～3次，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中打散，得到菌懸液，細胞濃度控制在106個/mL左右。取上述菌懸液5 mL于平皿中，將其放在磁力攪拌器上，置于15 W紫外燈下 30 cm 處，照射一定時間（30、60、90、120、150 s）后轉(zhuǎn)接入M26種子培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)2～4 h。取出后培養(yǎng)液按梯度稀釋并涂布VY/2平板，30℃恒溫培養(yǎng)5 d。以未經(jīng)過照射的菌懸液作為對照，觀察生長情況并繪制致死率曲線。

2）亞硝基胍（NTG）誘變：取培養(yǎng)了 36～48 h 的M26培養(yǎng)物，離心，收集菌體，菌體用0.1 mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液洗滌兩次，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中打散，得到菌懸液，細胞濃度控制在106個/mL左右。取10 mL滅菌離心管，裝入4.0 mL菌懸液，加入 NTG 母液，配置成含 200、400、600、800、1 000 μg/mL NTG的菌懸液，進行誘變處理，30℃恒溫振蕩30 min。結(jié)束后立即用冷的生理鹽水離心洗滌終止誘變。然后轉(zhuǎn)接入M26種子培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)2～4 h。取出后培養(yǎng)液按梯度稀釋并涂布VY/2平板，30℃恒溫培養(yǎng)5 d。以未經(jīng)過照射的菌懸液作為對照，觀察生長情況并繪制致死率曲線。

1.2.2 培養(yǎng)方法

1）種子培養(yǎng)：將保藏在固體斜面培養(yǎng)基的菌種接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30℃下培養(yǎng)5～7 d，轉(zhuǎn)接于M26培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，在30℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)60 h后，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。

2）發(fā)酵培養(yǎng)：以10%接種體積分數(shù)將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為：250 mL三角瓶裝液量50 mL，在30℃、200 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)6 d。

1.2.3 埃博霉素B產(chǎn)量測定 發(fā)酵結(jié)束后，收集樹脂，用10倍體積甲醇振蕩浸提24 h后，棄去樹脂，甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干，再加入500 μL甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移到離心管中。采用HPLC定量分析，液相色譜條 件為： 色 譜柱 YWG，C18，10 μm，250 mm×4.6 mm；Waters-2487高效液相色譜儀；UV紫外檢測器：檢測波長249 nm，流動相為甲醇∶水=65∶35（體積比），上樣體積 20 μL，時間 30 min，流速 1 mL/min。埃博霉素B的定量采用本實驗室用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程如下：

Y=0.132X+0.0035

采用HPLC檢測埃博霉素B所得的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成埃博霉素B產(chǎn)量。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 Plackett-Burman（P-B） 設(shè)計 Plackett-Burman設(shè)計用來確定對埃博霉素B產(chǎn)量有顯著影響作用的因子以及去除一些可有可無的因子。每個因子設(shè)置高低兩個水平， 分別用 “+”、“－“表示，用SAS9.2軟件設(shè)計。

1.3.2 最陡爬坡實驗 根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，對篩選出的顯著因素的變化方向、步長作了相應(yīng)的設(shè)計。

1.3.3 Box-Behnken實驗 根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，確定顯著因子的高、中、低水平，表征為 1、0、-1，用SAS9.2軟件設(shè)計實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 埃博霉素B高產(chǎn)菌株的誘變育種

2.1.1 紫外誘變 為了選擇合適的誘變處理時間，考察不同的紫外線照射時間對菌株的致死作用，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著紫外線照射時間延長，菌株致死率升高，當(dāng)紫外照射時間為80 s時，菌株致死率接近100%。由于篩選突變株的最佳致死率應(yīng)控制在70%～85%，故最佳誘變時間確定為50 s。

2.1.2 NTG誘變 在進行NTG誘變時，首先考察了不同誘變劑量對菌株的致死作用，誘變時間固定為30 min。細菌的一般處理質(zhì)量濃度為100～1 000 μg/mL[12]， 考察 NTG 終質(zhì)量濃度為 200、400、600、800、1 000 μg/mL時對菌株的致死作用。實驗結(jié)果見圖2。然后在最佳NTG終質(zhì)量濃度下，改變處理時間（10、30、50、70 min），實驗結(jié)果見圖 3。

圖1 紫外對菌株的致死曲線Fig.1 Effect of UV on strain fatality rate

圖2 NTG質(zhì)量濃度對菌株的致死作用Fig.2 Effect of concentration of NTG on strain fatality rate

圖3 NTG誘變時間對菌株的致死作用Fig.3 Effect of mutagenesis time of NTG on strain fatality rate

從圖2和圖3可以看出，隨著NTG終質(zhì)量濃度的增加和處理時間的延長，菌株的致死率都呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度為800 μg/mL時，菌株致死率接近100%，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度為400 μg/mL時，菌株致死率為85%。當(dāng)NTG作用時間為30 min時，菌株致死率為80%，為了得到滿意的誘變結(jié)果，選擇致死率為80%～85%的致死濃度以及處理時間。故確定NTG誘變條件為：NTG終質(zhì)量濃度為400 μg/mL，處理時間為30 min。

2.1.3 復(fù)合誘變結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性試驗 經(jīng)過紫外-NTG復(fù)合誘變，將誘變后的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，HPLC檢測埃博霉素B產(chǎn)量，最終獲得突變株SoF5-H23，其埃博霉素B產(chǎn)量達到79.83 mg/L，是出發(fā)菌株SoF5-76（35.24 mg/L）的2.27倍。

將篩選出的高產(chǎn)埃博霉素B的菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接傳代5次后，進行搖瓶發(fā)酵試驗，HPLC檢測埃博霉素B產(chǎn)量，結(jié)果見表1。表明試驗篩選出的埃博霉素B的高產(chǎn)菌株遺傳性較穩(wěn)定。

表1 菌株SoF5-H23的遺傳穩(wěn)定性Table 1 Genetic stability of the strain SoF5-H23

2.2 突變高產(chǎn)菌株產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman設(shè)計篩選重要影響因素根據(jù)前期實驗結(jié)果，影響埃博霉素B產(chǎn)量的因素有：馬鈴薯淀粉、葡萄糖、豆餅粉、脫脂奶粉、七水硫酸鎂、無水氯化鈣、EDTA-Fe3+、微量元素、吸附樹脂、初始pH、裝液量、接種量、發(fā)酵溫度。本實驗選用N=20的Plackett-Burman設(shè)計，考察上述13個因素對埃博霉素B產(chǎn)量的影響。另設(shè)3個因素為虛擬變量，用于估計誤差。每個因素分別取兩個水平，以埃博霉素B產(chǎn)量為響應(yīng)值。實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，利用SAS9.2軟件對各因素主效應(yīng)分析的結(jié)果見表3。

P＜0.05為顯著因素，由表3可知，馬鈴薯淀粉（X1）、脫脂奶粉（X4）、初始 pH（X12）和溫度（X15）為影響埃博霉素B產(chǎn)量的顯著因素，在做響應(yīng)面實驗時，考察因素超過3個會使試驗次數(shù)顯著增加，在4個顯著因素中溫度的影響相對較小，選擇馬鈴薯淀粉（X1）、脫脂奶粉（X4）、初始 pH（X12）三個因素進一步做響應(yīng)面實驗。其余不顯著的變量的取值結(jié)合效應(yīng)的正負和節(jié)約正本的原則，進行調(diào)整。

2.2.2 最陡爬坡實驗 根據(jù)Plackett-Burman實驗分析的結(jié)果，結(jié)合實驗的實際需要，在最陡爬坡試驗中對埃博霉素 B產(chǎn)量影響顯著的因素的變化方向、步長作了相應(yīng)的設(shè)計，具體取值和實驗結(jié)果見表4。由表4可知，最佳因素的質(zhì)量濃度條件處于0+2Δ和0+3Δ之間，故以0+3Δ水平為后續(xù)實驗的中心點。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果及響應(yīng)值Table 2 Plackett-Burman design variables（in clded levels） with Epothilone B as response

表3 Plackett-Burman試驗中各因素的效應(yīng)分析Table 3 Levels of variables and analysis of the main effect for Plackett-Burman

表4 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

2.2.3 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果 三個重要因素的水平取值見表5，實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken實驗因素水平及編碼Table 5 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken

以埃博霉素B產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)表6中實驗結(jié)果，利用SAS軟件對結(jié)果進行二次回歸分析，獲得的回歸方程為：

Y=107.547+8.943X1-6.334X2-1.241X3-12.591X1X1-7.943X1X2-4.248X1X3-12.608X2X2+3.300X2X3-11.833X3X3

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表7，模型系數(shù)顯著性檢驗見表8。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 ANOVA of regression model

由表 7 可知，模型極顯著（Pr＞F 小于 0.01）；失擬項在 0.1水平上不顯著（P=0.100 8＞0.1），說明殘差均由隨機誤差引起，因此模型選擇正確。R2=0.983 2，說明模型可以解釋98.32%響應(yīng)值的變化，表明方程擬合較好，實驗結(jié)果和預(yù)測值之間具有較好的一致性。Y的變異系數(shù)CV表示實驗的精確度，CV值越高，實驗的可靠性越低，本實驗中CV值相對較低，說明了實驗操作可靠。

由表8方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗表明：模型一次項 X1和 X2極顯著； 二次項 X1X1、X1X2、X1X3、X2X2、X3X3對響應(yīng)值有顯著的影響，且X1（土豆淀粉）和X2（脫脂奶粉）有交互作用，交互作用顯著，說明發(fā)酵過程應(yīng)該控制好碳氮比。

表8 回歸方程中回歸系數(shù)的T值檢驗Table 8 Test of significance for regression coefficient

2.2.4 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件確定 利用SAS軟件根據(jù)回歸方程進行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面分析圖及其等高線圖，結(jié)果見圖4～6。考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，每個響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在中心點水平不變。曲面圖的形狀可反應(yīng)出各單因素對埃博霉素B的影響，曲面越陡峭，影響越顯著。從其等高線圖可以直觀看出兩因素的交互作用，等高線的形狀反映出交互作用效應(yīng)的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，等高線形狀越接近橢圓形表示交互作用越強。

圖 4 Y=f（X1，X2）響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X1，X2）

圖 5 Y=f（X1，X3）響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X1，X3）

圖6 Y=f（X2，X3）響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X2，X3）

從圖中及軟件分析，回歸方程存在穩(wěn)定點，即存在極值點 （X1，X2，X3） 使得響應(yīng)變量Y取得最大值。通過嶺脊分析（ridge analysis）得到極大值所對應(yīng)的各主要因素（X1，X2，X3）的編碼值分別為（0.514 228，-0.430 58，-0.200 42），即馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉、初始pH的最佳取值分別為4.757 1 g/L、2.284 7 g/L、7.399 8，此時埃博霉素 B產(chǎn)量達到最高為111.42 mg/L。

2.3 模型的驗證

為了證明預(yù)測結(jié)果的可靠性，在以上確定的最佳發(fā)酵條件下進行搖瓶發(fā)酵，驗證結(jié)果埃博霉素B產(chǎn)量為108.67 mg/L與預(yù)測結(jié)果十分接近，說明了實驗值和預(yù)測值之間具有良好的擬合性，模型的有效性，證明用響應(yīng)面法來尋找最佳發(fā)酵條件是可行的。

3 結(jié)語

工業(yè)微生物的菌種選育工作在發(fā)酵工業(yè)中占有重要的地位，是決定該發(fā)酵產(chǎn)品能否具有工業(yè)化生產(chǎn)價值及發(fā)酵過程成敗的關(guān)鍵。已有文獻[12]報道，通過對纖維堆囊菌進行NTG化學(xué)誘變，獲得兩株埃博霉素A產(chǎn)量為17.3、17.4 mg/L的優(yōu)良菌株。作者在選育方法上采用物理方法與化學(xué)方法相結(jié)合對出發(fā)菌株進行誘變處理，以此獲得高產(chǎn)菌株的目的。

作者以纖維堆囊菌SoF5-76為誘變出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和亞硝基弧復(fù)合誘變處理和選育，獲得一株高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定性較好的突變菌株SoF5-H23，其發(fā)酵產(chǎn)埃博霉素B的量可達79.83 mg/L，比出發(fā)菌株提高了1.27倍。

通過Plackett-Burman實驗和響應(yīng)面分析法對纖維堆囊菌產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝為：馬鈴薯淀粉4.8 g/L、脫脂奶粉2.3 g/L、無水氯化鈣 2 g/L、葡萄糖 0.5 g/L，豆餅粉2 g/L，七水硫酸鎂 2 g/L，EDTA-Fe3+2 mL/L，微量元素（TE）0.5 mL/L，吸附樹脂2%，培養(yǎng)基初始pH 7.4，裝液量50 mL，接種體積分數(shù)8%，溫度30℃。在此最優(yōu)條件下埃博霉素B產(chǎn)量為 108.67 mg/L，比優(yōu)化前提高了55.62%。

為了提高埃博霉素B的產(chǎn)量，作者首先對菌株進行誘變選育，獲得一株高產(chǎn)菌株，使得埃博霉素B產(chǎn)量從35.24 mg/L提高到79.83 mg/L（產(chǎn)量提高了1.27倍），然后對發(fā)酵工藝優(yōu)化，使得埃博霉素B產(chǎn)量達到108.67 mg/L，又提高了36.13%，整個過程中菌株誘變是產(chǎn)量提高的關(guān)鍵，分析產(chǎn)量提高的原因可能為：本研究的供試菌株是以四株野生菌為出發(fā)菌株通過Genome shuffling遞歸原生質(zhì)體融合獲得的菌株[13]，多株野生菌含有更加多樣的遺傳信息，通過遞歸原生質(zhì)體融合技術(shù)，累積了大量正突變效應(yīng)，通過本研究的理化復(fù)合誘變和發(fā)酵工藝優(yōu)化可能會使這種正效應(yīng)凸顯出來，獲得了較高的埃博霉素產(chǎn)量。此產(chǎn)量是國內(nèi)外報道的埃博霉素最高發(fā)酵產(chǎn)量，表明傳統(tǒng)生物工程技術(shù)在工業(yè)微生物領(lǐng)域仍然具有較高的應(yīng)用價值。

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