直接發酵法生產L-絲氨酸高產菌株的選育

徐國強 ， 竇文芳 ， 許泓瑜 ， 張曉梅 *

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122）

L-絲氨酸（L-serine）是一種非必需氨基酸，具有重要的生理功能，在醫藥、食品、化妝品及化工等領域具有重要的應用價值。L-絲氨酸的市場需求量很大[1]。目前，L-絲氨酸的主要生產方法有化學合成法、蛋白質水解法和前體轉化法，而這些方法存在成本較高、產率較低及環境污染較大等問題，限制了L-絲氨酸的規模化生產。相比之下，以可再生資源糖為原料的微生物發酵法生產L-絲氨酸則受到廣泛關注。

目前，發酵生產L-絲氨酸的微生物主要有黃色短桿菌[2]、重組大腸桿菌[3]和谷氨酸棒桿菌[4-5]。其中谷氨酸棒桿菌（Corrynebacterium glutamicum）已廣泛地用于各種氨基酸的生產，由于谷氨酸棒桿菌的生理學、生物化學及遺傳學信息已較為豐富[6]，對其進行進一步的代謝工程改造也較為方便，因此，采用谷氨酸棒桿菌來生產L-絲氨酸具有諸多的優勢。

谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸的合成途徑見圖1。主要有3個關鍵酶：包括3-磷酸甘油酸脫氫酶（PGDH，serA）、 磷 酸 絲 氨 酸 氨 基 轉 移 酶 （PAST，serC）、磷酸絲氨酸磷酸酶（PSP，serB）。 降解途徑包括2個關鍵酶，分別是L-絲氨酸羥甲基轉移酶（SHMT，glyA）和 L-絲氨酸脫氫酶（L-serDH，sdaA）。Peters-Wendisch P等[7]證實了高濃度的L-絲氨酸對C.glutamicum中的PGDH存在反饋抑制作用。他們對L-絲氨酸代謝途徑中的關鍵酶進行了改造，使得模式菌株C.glutamicum ATCC13032可以積累L-絲氨酸到[4，8-9]。而關于野生型谷氨酸棒桿菌產L-絲氨酸卻鮮有報道。作者所在實驗室前期從土壤中篩選獲得一株可以利用糖質原料發酵生產L-絲氨酸的野生型C.glutamicum SYPS-062，并對該菌株展開了一系列的研究[5，10-14]。但還是存在L-絲氨酸產量較低發酵周期較長等問題，擬采用L-絲氨酸結構類似物D-絲氨酸抗性平板篩選突變株從而解除L-絲氨酸對PGDH的反饋抑制，促進L-絲氨酸的進一步積累。

利用誘變育種技術獲得具有優良性狀的突變株，然后通過全基因組測序找出引起優良性狀的遺傳差異，進而運用代謝工程的手段對菌株進行定向改造[15]，這種利用反向代謝工程改造菌株的策略將具有明顯的優勢。作者旨在通過傳統誘變育種的方法，獲得L-絲氨酸產量等發酵特性明顯變化的C.glutamicum突變株，為下一步進行反向代謝工程研究提供有價值的實驗材料。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of L-serine in C.glutamicum

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 C.glutamicum SYPS-062：可直接利用糖質原料發酵生產L-絲氨酸，由江南大學制藥工程研究室保藏。

1.1.2 培養基

1） 斜面培養基：Peptone 10 g/L，Beef extract 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 3 g/L，Agar 20 g/L；pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

2）種子培養基：Glucose 30 g/L，corn steep liquor 20 g/L， （NH4）2SO420 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CO（NH2）21.5 g/L，cottonseed flour 20 g/L；pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min。

3）發酵培養基：Sucrose 60 g/L，（NH4）2SO430 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.02 g/L，biotin 50 μg/L，streptomycin 10 μg/L，CaCO330 g/L， 維生素 B1450 μg/L；pH 7.0，121 ℃滅菌 10 min。

4）抗性篩選培養基：Peptone 10 g/L，Beef extract 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 3 g/L，Agar 20 g/L，在此基礎上加入D-serine，使其在培養基中的終質量濃度為150 g/L。

1.1.3 試劑 DES：為上海試劑廠產品；D-serine：為美國Sigma公司產品；其他均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

1）斜面活化及種子培養：將保存在4℃冰箱中的斜面菌種接種到新鮮斜面，30℃靜置培養24 h；然后將活化后的菌種接入種子培養基（裝液量為30 mL/250 mL 三角瓶），115 r/min、30 ℃振蕩培養 18 h。

2）搖瓶發酵：按5%的接種體積分數將種子培養液接入發酵培養基 （裝液量為20 mL/250 mL三角瓶），115 r/min、30 ℃振蕩培養 96 h。

1.2.2 誘變方法及D-serine抗性變異株的檢測方法 先將種子培養到對數生長期中后期，再以50%的接種體積分數轉接到新鮮的種子培養基中培養5 h，使所有細胞達到同步生長。將培養液無菌離心，收集菌體，用無菌的0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液將菌體制成108個/mL的菌懸液，離心洗滌3次，轉入無菌的帶玻璃珠的三角瓶中打散，得單細胞懸液。取1 mL的菌懸液，加入硫酸二乙酯，使其終體積分數為2%，30℃振蕩反應20 min，誘變結束后快速離心終止反應，用無菌的0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌3次，將誘變后的單細胞懸液接種到新鮮的種子培養基培養8 h，然后直接涂布抗性篩選平板，30℃恒溫培養3～5 d，長出的大菌落即為D-serine r，挑選這些菌落進行初篩。

1.2.3 分析方法 細胞干重的測定 （dry cell weight，DCW）：取發酵液 5 mL，加 12 mL 0.25 mol/L的稀鹽酸，待反應完畢后，經8 000 r/min離心5 min后傾去上清液，用去離子水洗滌兩次，置于105℃烘箱干燥至恒質量后稱量；蔗糖測定方法：采用間苯二酚法；L-絲氨酸定量測定方法：采用日立835-50氨基酸自動分析儀。色譜條件如下：柱溫為40℃；流速為 1.0 mL/min；紫外檢測器：338、262 nm （Pro，Hypro；熒光檢測器：激發波長340 nm，發射波長450 nm；激發波長 266nm，發射波長 305nm （Pro，Hypro）。

2 結果與分析

2.1 出發菌株及誘變培養時間的確定

將C.glutamicum SYPS-062的斜面保藏菌種劃線分離，挑選菌落形態較大的32個單菌落轉接到斜面上，培養24 h后接種至搖瓶進行產酸能力的初篩，再將產酸較高的5株菌進行復篩，結果發現36號菌產酸最高，然后將該突變株連續傳代5次考察其遺傳穩定性，發現其產酸未見明顯變化。表明其遺傳穩定性較好，因此，確定菌株C.glutamicum SYPS-062-36為誘變的出發菌株，用于后續相關實驗。

出發菌株的生長曲線見圖2。從種子生長曲線上可以看出，該菌經過16～18 h的培養后，到達對數生長中后期，此時細胞代謝活力最為旺盛，并且處在這個時期的細胞對誘變劑更為敏感。因此，確定誘變所用細胞的培養時間為16～18 h。

圖2 出發菌的種子生長曲線Fig.2 Growth curve in the seed medium of parent strain

2.2 誘變育種

以硫酸二乙酯（DES）為誘變劑，誘變時間為20 min，測定了誘變劑濃度與致死率的關系，結果見表1。從表1可以看出，選擇誘變劑體積分數為2%比較合適，此時致死率為71.8%。

表1 對菌株C.glutamicum SYPS-062-36 DES誘變致死率Table 1 Determination of the lethality on C.glutamicum SYPS-062-36 treated by DES

對出發菌株SYPS-062-36（圖3a）進行誘變，在150 g/L D-絲氨酸抗性平板上隨機挑選突變株，獲得一株產酸較高P3，其產酸為（7.35±0.21）g/L，然后對突變株P3在同樣的條件下進行第二輪誘變，經搖瓶復篩，獲得一株高產L-絲氨酸菌株SYPS-062-33a，將該突變株劃線分離，得到一株遺傳穩定的高產菌株SYPS-062-33a-18，其顯微圖像見圖3b。

圖3 谷氨酸棒桿菌SYPS-062-36及其突變株SYPS-062-33a-18的顯微鏡圖Fig.3 Microscope images of C.glutamicum SYPS-062-36 and its derivative SYPS-062-33a-18

2.3 高產菌株的發酵特性

高產菌與出發菌在發酵過程中生物量、L-絲氨酸產量、殘糖含量的變化見圖4。由圖4可以看出，菌體進入對數生長后期時，高產菌的生物量明顯高于出發菌，發酵結束時，生物量為（6.56±0.23）g/L，而出發菌株為（5.61±0.24）g/L，較出發菌株提高了17.9%。高產菌在90 h時L-絲氨酸產量達到最高，為（11.0±0.25）g/L，L-絲氨酸產量較出發菌（6.65±0.23）g/L提高了65.4%，且發酵周期提前約6 h；高產菌株在對數生長前期（24～60 h）糖耗速率不及出發菌株，但在對數生長中后期（60～78 h）的糖耗速率高于出發菌株。

文獻[16-17]報道，在谷氨酸棒桿菌胞內，大約7.5%的碳流是用于細胞生長和代謝所需（如蛋白質的合成、甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸、磷脂的合成及一碳單元的產生）。本課題組前期研究發現：出發菌株C.glutamicum SYPS-062積累L-絲氨酸的原因可能與SHMT活性較低有關[10]。在本研究中，高產菌株C.glutamicum SYPS-062-33a-18的L-絲氨酸對蔗糖的轉化率為0.183±0.009 mol/mol，較出發菌株C.glutamicum SYPS-062提高了64.9%，說明誘變使得更多的碳流流向L-絲氨酸。

圖4 出發菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062-36和其突變株SYPS-062-33a-18的發酵過程曲線Fig.4 Time course of L-serine fermentation by the parental strain C.glutamicum SYPS-062-36 and the mutant C.glutamicum SYPS-062-33a-18 in shake-flask fermentation

此外，將出發菌及高產菌分別發酵96 h和90 h，發酵液經過預處理后，在相同條件下測定氨基酸組分及含量。結果表明：出發菌的丙氨酸（Ala）產量為（2.05±0.15） g/L，纈氨酸 （Val）的產量為（1.51±0.19）g/L；相比之下，高產菌株的丙氨酸產量為（6.56±0.24） g/L，纈氨酸的產量為（3.00±0.20）g/L，分別較出發菌株提高了220%和99%。甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）等的產量也有了較大幅度的提高。

3 結語

以谷氨酸棒桿菌C.glutamicum SYPS-062-36為出發菌株，經DES逐級誘變處理，獲得對D-絲氨酸有一定抗性的突變株C.glutamicum SYPS-062-33a-18，其 L-絲氨酸產量為（11.0±0.25） g/L，較出發菌株產酸量提高了65.4%。此外，突變株C.glutamicum SYPS-062-33a-18可以積累更多的丙氨酸、纈氨酸等其它氨基酸。本研究不僅以D-絲氨酸作為抗性平板篩選得到高產L-絲氨酸的突變株，而且為下一步進行反向代謝工程的研究提供了良好的實驗材料。

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