基于KGdF4:Tb3+納米材料檢測四環素的生物傳感新方法

段 諾， 吳世嘉， 王周平

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214036；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

四環素（Tetracycline，Tc）是四環素類抗生素的一種，是由放線菌屬產生的一類廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌、立克次氏體等均有抑菌作用[1]。近年來，四環素被廣泛應用于飼料添加劑，一方面能夠有效地預防和治療魚類、畜禽類的疾病，另一方面可促進其生長速度，控制生殖周期和繁育能力。然而一些不法分子為了經濟效益，常濫用這類藥物，致使其在動物性食品中大量殘留，不僅危害人體健康，而且更為嚴重的是畜禽產品中殘留較低濃度的四環素類抗生素容易誘導各種致病菌產生耐藥性，不利于對人類和畜禽類疾病的治療[2-4]。目前，國內外對于四環素殘留常用的檢測方法有微生物法[5]、薄層層析法[6]、液相色譜法[7-9]、酶聯免疫法[10-11]等。上述方法均具有靈敏度高、重復性好等特點。然而上述方法也存在耗時、設備昂貴、樣品前處理步驟繁瑣等缺點。因此構建快速、準確、靈敏的食品安全檢測新方法新技術，對于實現四環素的超痕量檢測具有重要意義。

鑭系元素摻雜的新型納米材料KGdF4：Ln3+納米粒子是一類具有顯著熒光發射的粒子，相比于傳統的熒光染料和量子點，KGdF4：Ln3+納米粒子具有以下顯著的優點：較長的熒光壽命，可以很好的消除散射光對于熒光檢測的干擾、較大的斯托克斯位移（＞50 nm）、較窄的熒光發射峰形（＜10 nm）、低毒性以及很高的抗光漂白性[12-13]。目前KGdF4：Ln3+納米粒子在生物大分子檢測分析、醫療診斷分析等方面具有比較廣泛的應用。

氧化石墨烯也是一類具有非常良好的電子、機械和熱性能的納米材料，近年來備受關注[14]。研究表明，單鏈DNA可以通過π-π共軛大量的吸附在氧化石墨烯的表面[15]。而由于磷酸骨架中的核苷酸堿基的遮蔽作用，導致氧化石墨烯對于DNA雙鏈以及折疊的DNA復合物的吸附能力相對較弱[16]。與此同時，氧化石墨烯具有較寬的紫外吸收，是一種高效的熒光淬滅劑，這些特性使得氧化石墨烯成為一種優良的檢測平臺[17-18]。

作者利用KGdF4：Ln3+納米粒子作為熒光分子，氧化石墨烯作為熒光淬滅分子，結合適配體與目標物質的高親和力和高特異性識別，構建了一種靈敏、高效的熒光共振能量轉移體系檢測四環素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四環素標準品：購自上海晶純科技股份有限公司；氟化銨、氯化鉀、氯化鈉、乙二醇、戊二醛等：購自國藥集團化學試劑有限公司；聚丙烯亞胺：購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；GdCl3·6H2O、TbCl3·6H2O、親和素：購自 Sigma 公司；牛奶樣品：購自無錫華潤萬家超市。四環素適配子[19]5'-biotin-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTG GGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3'：由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計UV-1800：日本島津公司；冷凍離心機：德國eppendorf公司；ZD-85氣浴恒溫振蕩器：上海比朗儀器有限公司；JEM2100透射電鏡：日本JEOL公司；熒光光譜儀FLUORMAX-4：美國HORIBA公司；X射線衍射儀D8：德國布魯克AXS有限公司；傅立葉變換紅外光譜儀Nicolet iS10：美國賽默飛公司；Direct-Q3超純水系統：美國Millipore公司。

1.3 氧化石墨烯的制備

在Hummers方法的基礎上做改進[20]，利用石墨粉末得到氧化石墨烯。稱取2 g石墨薄片和1.6 g NaNO3，在冰浴狀態下加入67.5 mL濃硫酸中。隨后緩慢加入 9 g KMnO4反應溶液中，35℃攪拌 30 min。隨后560 mL溫水緩慢加入溶液中形成糊狀，再加入 30%H2O2，室溫條件下連續攪拌5 d，溶液逐漸變為亮黃色。最后將懸液離心，用去離子水清洗多次，在真空干燥箱中70℃干燥得到氧化石墨烯片層。

1.4 鑭系元素摻雜的KGdF4：Tb3+納米材料的制備

將 2.0 mmol KCl、1.0 mmol GdCl3·6H2O、0.01 mmol TbCl3·6H2O、1 mL（300 mg/mL）聚丙烯亞胺以及20 mL乙二醇加入至100 mL圓底燒瓶中，充分攪拌至所有固體溶解。另取8 mmol NH4F加入至燒杯中，并加入20 mL乙二醇，放入40℃水浴鍋中恒溫攪拌至固體全部溶解。后將溶解的NH4F逐滴加入至圓底燒瓶中，充分攪拌1 h，形成懸浮液。將懸浮液轉入至高溫反應釜中，放入電熱鼓風干燥箱195℃恒溫加熱4 h。反應結束后將產物分裝入離心管中，10 000 r/min離心15 min。棄上清液，沉淀用乙醇以及超純水超聲清洗三次。最后成品烘干，研成粉末保存，即制得鑭系元素摻雜的KGdF4：Tb3+納米粒子。

1.5 KGdF4：Tb3+納米粒子-四環素適配體復合物的制備

將 15 mg KGdF4：Tb3+納米粒子于 5 mL PBS 中超聲分散 20 min，之后加入 1.25 mL（1.06 g/mL）戊二醛，37℃恒溫振蕩2 h。然后用PBS超聲清洗三次 （9 000 r/min、10 min）。 所得沉淀于0.9 mL PBS中重懸，加入0.1 mL（1 mg/mL）親和素，37℃恒溫振蕩6 h。反應結束后用結合緩沖液 （20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、pH 7.0）清洗 3 次，加入 20 μL（10 μmol/L）生物素化的四環素適配體，37℃恒溫振蕩2 h。之后用結合緩沖液清洗3次（9 000 r/min、10 min），再用結合緩沖液配制成1 mg/mL的體系，構成KGdF4：Tb3+納米粒子-四環素適配體復合物。放入4℃冰箱保存備用。

1.6 四環素檢測

配制不同濃度的四環素標準樣品（0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL）， 分別與上述制備的 KGdF4：Tb3+納米粒子-四環素適配體復合物于37℃孵育1 h，然后加入氧化石墨烯（100 μL，1 mg/mL），37 ℃繼續孵育1.5 h。最后使用熒光光譜儀FLUORMAX-4測定樣品熒光光譜，設定激發波長273 nm，考察發射峰543 nm處熒光強度。

1.7 牛奶樣品中四環素加標回收實驗

利用建立的方法對牛奶中的四環素進行檢測，對牛奶樣品的處理方法為：取10 mL牛奶，在10℃下7 000 r/min離心10 min，完全去除上層脂肪層。將得到的樣本用去離子水1∶20稀釋，再經過一次性注射式濾器過濾，最終得到待測溶液。配制不同濃度的四環素標準溶液加入待測溶液中，利用本設計方法檢測其中四環素的含量，計算檢測值，得到回收率。

2 結果與分析

2.1 四環素的檢測原理

KGdF4：Tb3+納米粒子的表面富含氨基，并通過戊二醛法與親和素進行連接，之后再與生物素化的四環素適配體進行結合，構成熒光供體探針。同時我們制備得到了氧化石墨烯單片層，通過紫外掃描發現其在300～700 nm之間存在廣泛的紫外吸收區，并且與制備得到的KGdF4：Tb3+材料的熒光發射譜重疊，也就意味著氧化石墨烯可以作為能量受體淬滅KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光。據此設計了一個熒光共振能量轉移體系檢測四環素的方法，技術原理見圖1。將KGdF4：Tb3+-四環素適配體熒光供體探針與氧化石墨烯共同孵育，由于π-π堆積作用，適配體（單鏈DNA）就會被固定到氧化石墨烯片層表面，致使KGdF4：Tb3+熒光被氧化石墨烯淬滅。當加入目標物質四環素時，四環素與熒光供體探針上的適配體發生特異性結合從而降低了適配體表面電荷，使得這部分適配體不具備與氧化石墨烯π-π共軛結合的能力，從而不會吸附在氧化石墨烯片層表面，KGdF4：Tb3+熒光得以保留，據此可實現四環素的定量檢測。

圖1 基于熒光共振能量轉移的四環素檢測原理圖Fig.1 Schematic representation of the detection of tetracycline using FRET

2.2 材料表征

所制備的KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光光譜見圖2a所示，在激發波長273 nm下，KGdF4：Tb3+納米粒子在540 nm左右處有顯著的發射峰。利用TEM對KGdF4：Tb3+納米粒子的形貌進行表征，由圖2b可見，KGdF4：Tb3+納米粒子在水中分散性良好，顆粒都趨于球形，粒徑在25～30 nm左右，且分布較為均勻。對KGdF4：Tb3+納米粒子進行X射線衍射表征，結果見圖2c所示。該納米粒子粉末的X射線衍射圖譜可以完全索引到KGdF4的純立方相，可以表明該粉末具有高度結晶的KGdF4晶體存在，沒有其他晶體雜質的干擾。對KGdF4：Tb3+納米粒子進行紅外光譜表征。聚乙烯亞胺在KGdF4：Tb3+納米粒子的合成過程中包覆于材料表面，為該材料提供了豐富的氨基與亞氨基，使其形貌良好，生物相容性佳。如圖2d所示，在1 396 cm-1處的紅外峰為C-N鍵的伸縮振動，2 950、2 856 cm-1處的紅外峰分別為C-H鍵的非對稱與對稱伸縮振動。在1 625 cm-1處的顯著紅外峰為氨基中N-H鍵的特征峰，由此可以表征聚乙烯亞胺的成功包被，使得KGdF4：Tb3+納米粒子的表面具有豐富的活性基團，可為后續的親和素連接提供基礎，并可大幅的改良其在水中的分散性與生物相容性。

圖2 KGdF4：Tb3+納米粒子熒光光譜圖 （a）， 透射電鏡圖（b），X 射線衍射圖譜（c）和紅外光譜光譜圖（d）Fig.2 Fluorescence spectra （a），TEM image （b），XRD image （c），FT-IR spectra ofKGdF4：Tb3+nanoparticles（d）

2.3 氧化石墨烯的表征

從圖3a可以清楚的看到氧化石墨烯片層的薄片，以及特有的褶皺和卷邊的現象，可以確認氧化石墨烯單片層制備成功。另外，測定了氧化石墨烯的紫外吸收光譜，由圖3b中看到，氧化石墨烯具有非常寬泛的紫外吸收大約包含了從300～700 nm的范圍，而恰好此范圍與KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光發射光譜重疊，這意味著KGdF4：Tb3+納米粒子發射的熒光將被氧化石墨烯吸收從而發生熒光淬滅。

圖3 氧化石墨烯透射電鏡圖（a）和紫外吸收光譜圖（b）Fig.3 TEM image （a） and UV-visible absorption spectrum（b） of graphene oxide

2.4 KGdF4：Tb3+納米粒子與親和素連接的表征

本實驗中KGdF4：Tb3+納米粒子-四環素適配體復合物由KGdF4：Tb3+納米粒子與四環素適配體構成，二者的連接通過親和素與生物素的特異性結合來完成。其中四環素適配體5'端修飾了生物素，KGdF4：Tb3+納米粒子與親和素則按照1.5所述方法進行連接。利用紫外-可見吸收光譜對其是否成功連接進行了表征。由圖4中曲線A可以看出，親和素在未與KGdF4：Tb3+納米粒子連接之前在280 nm處有明顯的紫外吸收峰；當親和素與KGdF4：Tb3+納米粒子進行孵育之后，離心收集所得上清液的紫外吸收圖譜見曲線B。此時在親和素280 nm處的紫外特征吸收峰峰值大幅降低。從而表明親和素已成功固定到KGdF4：Tb3+納米粒子的表面。

圖4 親和素原液（曲線A）與孵育后上清液（曲線B）的紫外-可見吸收圖譜Fig.4 UV-visible absorption spectrum of avidin（curve A）and the supernatant after incubation（curve B）

2.5 熒光共振能量轉移體系

如圖5所示，連接了四環素適配體的KGdF4：Tb3+納米粒子作為能量供體探針，當能量供體探針與氧化石墨烯連接后，KGdF4：Tb3+納米粒子熒光被氧化石墨烯淬滅 （曲線A），而將無適配體修飾的KGdF4：Tb3+納米粒子與氧化石墨烯混合掃描熒光圖譜 （曲線B），KGdF4：Tb3+納米粒子熒光強度略有下降。由此可以推斷，KGdF4：Tb3+納米粒子熒光的淬滅是因為適配體修飾后KGdF4：Tb3+納米粒子通過ππ效應能夠吸附到石墨烯表面，從而拉近了能量供體與能量受體間的空間距離，導致了熒光共振能量轉移現象的發生。由此表明，具有適配體功能化的熒光生物探針是本實驗建立的關鍵要素。

圖5 KGdF4：Tb3+納米粒子-適配體復合物與氧化石墨烯孵育后的熒光光譜（a）和KGdF4：Tb3+納米粒子與氧化石墨烯孵育后的熒光光譜（b）Fig.5 Fluorescence spectra of KGdF4：Tb3+-aptamer after the incubation with graphene oxide （a），fluorescence spectra of the KGdF4：Tb3+after the incubation with graphene oxide（b）

2.6 線性范圍與檢測限

根據實驗原理檢測體系中不存在被測物四環素時熒光強度為最低值，隨四環素質量濃度增加體系熒光強度隨之增強，在最佳實驗條件下，KGdF4：Tb3+納米粒子在543 nm處的熒光發射峰與四環素質量濃度在0.5～100 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系 （圖6a）。回歸方程為y=430.0x+75 095（R2=0.993），最低檢出限（3S/N）為 0.25 ng/mL，其中 y 為熒光強度，x為四環素質量濃度。10次重復檢測10ng/mL的四環素溶液以評價該方法的精密度，其相對標準偏差為2.5%，因此本實驗具較好的靈敏度與準確性。圖6b為加入不同質量濃度四環素的熒光圖譜。

2.7 特異性研究

為了評價本實驗方法對于四環素的特異性，實驗考察了與四環素類似的抗生素：金霉素、土霉素、強力霉素與氯霉素在此方法下的檢測效果。在所構建的檢測系統中，分別加入10 ng/mL的四環素、金霉素、土霉素、強力霉素與氯霉素，測定該檢測體系熒光值，結果見圖7。四環素在該檢測體系中引起的熒光強度的變化遠遠高于其余四種物質。這是因為四環素適配體與四環素發生特異性結合，導致熒光共振能量轉移體系破壞，熒光強度大幅的恢復；而四環素適配體對于其余四種物質不具備高親合力，此時四環素適配體修飾的熒光納米粒子仍大量的被氧化石墨烯所吸附，體系中的熒光被大幅的淬滅。綜上所述，基于四環素適配體與四環素的高度特異性使得該檢測方法具有良好的選擇性。

圖6 四環素質量濃度與體系熒光強度的標準曲線（a）和不同四環素質量濃度條件下體系的熒光圖譜（b）Fig.6 Standard curve of the fluorescence intensity versus the tetracycline concentration（a），typical recording output for the detection of different concentrations of tetracycline using the developed method（b）

圖7 四環素檢測方法的特異性分析Fig.7 Specificity analysis of tetracycline detetion

2.8 加標回收實驗

表1所示為本文方法測得的四環素質量濃度與應用傳統高效液相色譜法所得的四環素質量濃度，二者結果基本一致，高效液相色譜法所得回收率在95.3%～102%之間，該實驗方法所得回收率在96.1%～102.5%之間，說明本法可用于實際樣品的檢測。

3 結語

根據氧化石墨烯的紫外吸收光譜與KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光光譜相重疊這一現象，結合單鏈適配體與氧化石墨烯的π-π共軛作用及其與目標物質的高親和力和高特異性，構建了一種利用熒光共振能量轉移體系檢測四環素的方法。本研究制備的KGdF4：Tb3+納米粒子是一種低度的，具有良好生物相容性的綠色納米材料，適配體為體外合成，成本低，穩定性好，特異性強。因而該方法操作簡單、靈敏度高，可以作為檢測四環素的備選方法。

表1 牛奶樣品中四環素的檢測回收率（n=5）Table 1 Recovery of tetracycline detection in milk samples（n=5）

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