姬菇菇腳對紅曲霉菌絲生長和產色素的影響

苗玉志， 任 堯， 李 維， 葛方蘭

（四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101）

紅曲色素是由紅曲霉（Monascus spp.）經發酵產生的天然安全食用色素[1-2]，具有色澤鮮紅、著色力強、穩定性好、口味自然等優點，能抑菌[3]、抗氧化[4]、抑制脂肪酶活性[5]、調節血脂[6]、抗腫瘤[7-8]等功能，已被廣泛應用于各種食品[9-10]。傳統的紅曲色素多以大米為底物發酵生產，其成本相對較高。近年來，為減少環境污染和降低生產成本，各種農業副產物已被廣泛應用于發酵工業[11-12]。在紅曲色素的生產方面，同樣開展了以低廉的玉米芯[13]、甘蔗渣[14]、葡萄渣[15]、土豆粉[16]等為底物的發酵實驗，而以姬菇菇腳為底物進行紅曲色素的生產經檢索國內外尚無報道。

姬菇菇腳是姬菇（Pleurotus cornucopiae）[17]在采收和加工過程中產生的農業副產物。我國姬菇栽培量大，僅就四川金堂縣每年栽培規模就達3.9億袋，總產量為31.6萬t，產值12億元[18]，而姬菇菇腳占整個鮮菇質量的9%左右，目前菇腳基本上按垃圾廢棄物處理，造成一定程度上的環境污染和資源的極大浪費。同時，菇腳同其子實體一樣富含多種營養成分[19-20]，具有極高的使用價值。作為農業廢棄物的姬菇菇腳，如果能夠用來發酵生產紅曲色素，不僅可以降低生產成本，解決廢棄菇腳所造成的環境污染，同時也可為菇腳變廢為寶開辟新的途徑。

作者以姬菇菇腳為底物通過平板培養和液態發酵探究了姬菇菇腳對紫紅曲霉MR02菌絲生長及紅曲色素生產的影響，以評估姬菇菇腳是否適合作為底物用于紅曲色素的發酵生產，所得結果可為以姬菇菇腳為底物生產紅曲色素的培養基配方及發酵工藝優化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：紫紅曲霉MR02（Monascus purpureous MR02）：作者所在實驗室分離鑒定并保存；姬菇菇腳：收集于成都市金堂縣清江鎮姬菇種植基地。收集后經清洗、風干、粉碎成粉備用；NaNO3、KH2PO4、MgSO4：分析純；乳酸：食品級。

1.2 儀器與設備

TH-1901型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱：上海精宏公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海鴻都公司；IS-RSV1型恒溫振蕩器：上海珂淮儀器公司；JD200-3電子天平：南北設備集團；1850R超速離心機：上海博翔公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基配制 普通培養基：大米粉質量分數3%、NaNO3質量分數 0.5%、KH2PO4質量分數0.15%、MgSO4質量分數 0.1%、pH 5.5～6.0（乳酸調）、平板添加瓊脂粉質量分數1.8%；菇腳培養基：普通培養基+質量分數6%的菇腳；液體培養基：按照試驗設計配制。所有培養基在121℃下滅菌20 min。

1.3.2 培養方法

1）平板培養：從母種斜面上接約0.5 cm2菌塊到活化平板上，30℃恒溫培養5 d，得到活化菌種，從活化平板上分別接約0.5 cm2圓形菌塊到普通平板和菇腳平板上，30℃恒溫培養，用于測定菌落直徑。

2）發酵搖瓶培養：用10 mL無菌水洗出1管活化斜面菌種接到種子培養基中，30℃、150 r/min培養72 h，得到種子液。以8%的接種體積分數分別接種到裝有80 mL液體培養基的250 mL三角瓶中培養，測定發酵液生物量和發酵液色素產量。

1.3.3 測定方法

1）平板菌絲增殖速率測定[21]：每天測定普通平板和菇腳平板上的菌落直徑，直至第10天。作3個平行試驗，取平均值。

2）菌體生物量測定[18]：吸10 mL發酵液真空抽濾得到菌絲體，用蒸餾水洗菌體，去凈底物成分，所得菌體用180 W微波干燥15 min，然后在干燥器中冷卻15 min，反復干燥至恒重后稱量。

3）色素色價測定[20-21]：取發酵液 10 mL，再加入體積分數75%的乙醇90 mL，靜置浸提4 h，浸提完畢后用濾紙過濾。濾液再以體積分數75%的乙醇稀釋適當倍數后，以體積分數75%的乙醇作空白對照，用分光光度計法，在505、420 nm下測吸光度值，發酵液總色價（U/mL）為：（OD505+OD420）×稀釋倍數。

1.4 菌絲平均增殖速率的計算

式中，dt為第t天時的菌落直徑 （mm）；d0為剛接種時的菌落直徑（mm）。

2 結果與分析

2.1 平板培養時姬菇菇腳對菌絲生長的影響

將紫紅曲霉MR02分別接種在普通平板和姬菇菇腳平板培養基中進行菌絲體增殖和產色能力培養，不同培養時間下菌絲增殖結果見表1。培養到第10天時的菌落和背面色澤見圖1。

表1 不同平板培養基中紫紅曲霉MR02的菌絲增殖速率Table 1 Growth rate of M.purpureous MR02 in different plate medium

圖1 普通培養基和菇腳培養基上的菌落和色澤Fig.1 Colony and color in general medium and P.cornucopiae stembase medium

由表1可知，紫紅曲霉MR02在普通平板上菌絲生長相對較慢，接種后的第2天才開始生長，第6天后菌絲增殖速率明顯放緩，培養到第10天時，菌落直徑為46.3 mm，平均增殖速率為4.13 mm/d。由于在菇腳平板培養基中添加菇腳，改善了培養基的營養組分，接種后菌絲體僅需很短時間來適應，在第1天就開始生長，持續增殖直到第10天，第10天時菌落直徑為59.7 mm，平均增殖速率為5.47 mm/d，同比菌落直徑增大了28.9%。

圖1顯示，普通平板培養基上的菌落明顯比菇腳平板培養基上的小，菌絲生長緩慢，長勢不好，并且菌落中央有菌絲體老化（圖1 a），而在菇腳平板培養基上菌絲長勢良好，菌塊中央無菌絲體老化（圖1 b）。從平板背面的色素圈大小和顏色來看，在普通平板培養基上的色素圈小且顏色較淺 （圖1 c），在菇腳平板培養基上的色素圈明顯較大且顏色較深（圖1 d）。因此，在普通平板培養基中添加姬菇菇腳能夠提高紫紅曲霉MR02菌絲體的增殖速度和產色素能力。

2.2 液體培養時菇腳對菌體形態和產色素的影響

紫紅曲霉MR02搖瓶發酵時，菌絲體主要以菌絲球的形式存在，而菌絲球的大小及結構對代謝產物合成有較大的影響[25]。在分別以普通液體培養基和添加質量分數6%的菇腳液體培養基中接種體積分數8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min的條件下培養192 h，測定菌絲球的外形尺寸，菌絲體生物量和發酵液色價結果見表2和圖2。

表2 紫紅曲霉MR02在兩種培養基中的發酵特點Table 2 Characters of M.purpureous MR02 shake flasks fermentation in two medium

圖2 紫紅曲霉MR02在普通培養基和菇腳培養基中的菌絲體形狀Fig.2 Mycelial pellets of M.purpureous MR02 in general and P.cornucopiae stembase fermention medium

由表2可知，紫紅曲霉MR02在菇腳液體培養基中的菌絲體生物量比在普通液體培養基中增加了41.5%，發酵液色價提高了25.1%。由圖2可知，在普通液體培養基（圖2a）中菌絲球直徑較大，數量較少，發酵液顏色較淡，這是由于在發酵后期，發酵液營養不足造成了菌絲自溶的出現。而在添加有6%的姬菇粉液體培養基中（圖2b），在發酵后期菌絲球直徑較小，數量較多，發酵液顏色較深，這是因為菇腳的添加使得發酵液營養較充足，能夠繼續維持菌絲體的生長，從而延長發酵時間，促進色素更多的合成，最終提高了色素產量。

2.3 以菇腳為底物的培養對菌絲體生物量和產色素的影響

大米是紅曲色素生產中的最佳底物，但其成本較高，基于產量和生產成本的考慮，作者采用大米和姬菇菇腳為底物進行實驗。在分別添加質量分數為0%、1%、2%、3%的大米粉和質量分數0%、3%、6%、9%、12%的菇腳發酵培養液中，接種體積分數8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min培養192 h，測得的菌絲體生物量色素產量見圖3。

圖3 大米和菇腳用量對生物量和色素產量的影響Fig.3 Effect of P.cornucopiae stembase and rice doses on biomass and pigment yield

圖3結果顯示，以不同配比的菇腳和大米為底物培養紫紅曲霉MR02時，對菌絲體生物量和色素產量均有顯著影響。可以看出，所有以姬菇菇腳和大米為共同底物培養的菌絲體生物量和色素產量均比以單一姬菇菇腳或大米為底物的產量要高。在大米粉質量分數為3%的不同菇腳配比中，在菇腳質量分數為6%的發酵液中色素產量最大，為85.97 U/mL，而菇腳質量分數為12%時，發酵液菌絲體生物量最大，為6.65 g/L；而在所有配比中，大米粉質量分數為1%和菇腳質量分數為9%的發酵液中，色素產量最大，為90.1 U/mL。同時在僅以姬菇菇腳為底物培養紫紅曲霉MR02時，雖然菌絲體生物量和色素產量明顯低于以大米粉和姬菇菇腳為共同底物的培養，但有不同數量的菌絲體和紅曲色素產生，尤其以質量分數12%菇腳為底物培養192 h的菌絲體的生物量和色素產量最高，分別為5.21 g/L和67.5 U/mL，這一結果也表明，只以姬菇菇腳為底物加適量的氮素和營養鹽能夠用于培養紫紅曲霉MR02生產紅曲色素。

2.4 菇腳對紫紅曲霉MR02生長動力學的影響

在分別以普通培養基、添加質量分數6%菇腳的普通培養基以及質量分數12%純菇腳液體培養基中接種體積分數8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min的條件下培養，通過測定在不同培養時間下的菌絲體生物量和色素產量來評估姬菇菇腳對紫紅曲霉MR02的生長動力學影響，菌絲生長和色素生產特性曲線見圖4。

圖4 紫紅曲霉MR02在不同液體培養基中的生長和產色曲線圖Fig.4 Curves ofgrowth and pigmentyield of M.purpureous MR02 in different liquid medium

從圖4可知，紫紅曲霉MR02在這三種液體培養基中的生長特性雖然都符合多細胞生物的生長曲線規律，但是其菌絲體生物量和色素產量隨培養基底物的不同而變化趨勢明顯。在添加6%菇腳的普通液體培養基中，紫紅曲霉MR02完成對數生長期所需時間為72 h，穩定期持續了96 h，菌絲體生物量和色素產量也相對最高；在普通液體培養基中，雖然紫紅曲霉MR02完成對數生長期所需時間同樣為72 h，但由于營養組分的差異，其穩定期只維持了72 h，菌絲體生物量和紅曲色素產量相對較低；而在只以姬菇菇腳（12%）為底物的液體培養基中，紫紅曲霉MR02完成對數生長期所需時間為120 h，穩定期僅僅維持了48 h，而菌絲體生物量和紅曲色素產量最少。如果將姬菇菇腳作為底物培養紫紅曲霉MR02生產紅曲色素，會出現生產周期長、色素產量低等問題，因而需要對其培養基組分進行優化實驗。

2.5 菇腳質量分數對菌絲體生物量和產色素的影響

在以質量分數6%、9%、12%、15%的菇腳為底物，接種體積分數8%的紫紅曲霉MR02，在30℃、150 r/min，經不同時間培養后測定的紫紅曲霉MR02的菌絲體生物量和色素產量見圖5。

從圖5可知，在以不同菇腳為底物的發酵液中，紫紅曲霉MR02在接種后第24小時開始生長，直到第120小時菌絲體生物量達最大，而后進入穩定期，在第192小時后菌絲體生物量開始降低。同時，自第72小時開始，發酵液緩慢變紅，開始產生紅曲色素，直到發酵的第216小時達到最大，不論是從最大菌絲體生物量和最高色素產量獲得的時間來看，都比采用大米和菇腳為共同底物的培養明顯延后。同時，菌絲體生物量和發酵液色價與菇腳質量分數具有明顯的相關性，在以6%的菇腳為底物的發酵液中，其生物量和色素色價明顯較低；在分別以9%、12%和15%的菇腳為底物的培養液中，生物量相對較高并非常接近。在菇腳質量分數為12%時，培養到第144小時，具有最大的生物量，為5.52 g/L，而在培養到第216 h，具有最大的紅曲色素產量，為72.92 U/mL。

圖5 不同質量分數菇腳對紫紅曲霉MR02的生物量和色素產量的影響Fig.5 Effect of stembase concentrations on biomass and pigment yield of M.purpureous MR02

3 結語

在普通培養基中添加質量分數6%的菇腳粉，通過平板培養紫紅曲霉MR02后，其平均增殖速率為5.47 mm/d，培養10 d后菌落直徑與在普通培養基上相比增大了28.9%，通過液體培養紫紅曲霉MR02后，菌絲生物量增加41.5%，發酵液色價同比提高25.1%。

分別以不同質量分數菇腳和大米的配比為底物培養紫紅曲霉MR02時，雖然以菇腳為單一底物的培養明顯低于以大米粉或大米和菇腳為共同底物的培養，但均有不同數量的菌絲體生物量和紅曲色素產生，在以12%菇腳為底物培養192 h時，菌絲體生物量和色素產量分別為5.21 g/L和67.5 U/mL，這表明只以姬菇菇腳為底物能夠用于培養紫紅曲霉MR02生產紅曲色素。

在只以姬菇菇腳為底物培養紫紅曲霉MR02的生長曲線符合多細胞生物的生長曲線規律，但其對數生長期較長，穩定期較短，從而使得紫紅曲霉MR02的菌絲體生物量和紅曲色素生成量明顯低于以大米或大米和姬菇菇腳為共同底物培養的產量。

在以不同質量分數的菇腳為底物對紫紅曲霉MR02進行培養，不同用量的菇腳發酵產生不同的菌絲體生物量和色素產量，最大產量在姬菇菇腳質量分數為12%，培養到第144小時的生物量（5.52 g/L）和培養到第216小時的紅曲色素 （72.92 U/mL）。這表明菌絲體生物量和紅曲色素產量與菇腳底物質量分數具有明顯的相關性，因而需要對姬菇菇腳促進紅曲霉菌的生長和產色機理以及培養基組分進行全面優化實驗。

因此，以紫紅曲霉MR02為出發菌株，以姬菇菇腳為底物發酵生產紅曲色素是切實可行的。下一步擬對用姬菇菇腳為底物發酵生產紅曲色素的培養基組分和發酵條件進行優化，有望進一步提高以姬菇菇腳為底物發酵生產紅曲色素的色價，為工業化利用姬菇菇腳生產紅曲色素提供技術支持。

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