高壓氧對蛛網膜下腔出血大鼠腦內基質金屬蛋白酶-9表達的影響

西安交通大學醫學院第一附屬醫院神經外科（西安710061） 姜海濤 朱 莽 金星星 謝江濤

蛛 網 膜 下 腔 出 血 （Subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種高病死率和高致殘率的神經系統急癥，但是盡管目前在診斷方法，血管內技術，手術技術及圍手術期的管理方面取得了很大的進步，SAH患者的預后仍然不佳［1］。血腦屏障損傷是SAH后腦損傷的重要環節［2］。SAH后顱內壓急劇升高、腦灌注壓和腦血流量迅速下降［3］，以及由于腦血管的自主調節功能紊亂［4］，這些因素共同造成了全腦的缺血缺氧，因此缺氧可能是SAH后腦損傷的原因之一。高壓氧（Hyper-baric oxygen，HBO）通過提高血氧分壓，提高血氧彌散距離，增加腦組織局部血液灌注和含氧量，改善腦組織缺氧狀況，促進損傷腦細胞的恢復；已證實高壓氧對腦缺血 再 灌 注［5，6］、腦 外 傷［7，8］、腦 梗 死［9，10］腦 出 血［11］及SAH 后DCVS［12，13］均有改善作用。但目前高壓氧對SAH的影響研究較少，本組通過測定HBO對SAH后血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）的影響，間接探討造成蛛網膜下腔出血后腦損傷原因。

材料與方法

1 動物與分組 健康雄性SD大鼠126只（由西安交通大學醫學院動物中心提供），體重280～320g，隨機分為假手術組18只，SAH組和HBO組按時間點12h、24h、72h共分6組，每組18只，分別用于測腦含水量6只、血腦屏障通透性6只及免疫組化6只。

2 SAH動物模型的制作 參照Lee［14］等方法制作SAH模型，大鼠麻醉成功后解剖并游離股動脈，并用1ml注射器穿刺股動脈采血約0．5ml；用4號半頭皮針穿刺枕骨大孔，將股動脈血0．3ml以0．1ml／min緩慢注入枕大池。保持大鼠俯臥位、頭低30度，持續30min，讓血液靠重力作用下進入基底池。對于假手術組大鼠，則往枕大池內注入0．3ml生理鹽水，其余步驟均相同。

3 高壓氧處理 HBO12h組于造模后1h，HBO 24H組于造模后1h、22h，HBO 72h組于造模后1h、22h、46h、70h，將大鼠放入自制80cm×80cm×120cm特制容器中，放入空氣加壓高壓氧艙內，并將純氧輸氧管與自制木箱相通，加壓速率為0．125mPa／min，加壓至0．2mPa，壓力穩定后向木箱提供純氧（氧濃度99．5%），在高壓氧狀態下停留60min，停留畢，以20min勻速減至常壓。假手術組與SAH組亦置于艙內，模擬除壓力和氧濃度外的類同實驗組的其它處理過程和實驗條件，各組動物出艙后于既定時間點處死。

4 腦含水量測定 各組大鼠分別在規定的時間點深度麻醉后斷頭取腦，去除腦干和小腦，用分析天平稱濕重（分度值0．1mg），然后置入試管內，在105℃恒溫干燥箱內烘烤至恒重（二次重量差≤0．2mg）后取出稱干重。按Elliott公式計算腦組織含水量（% ），腦組織含水量＝（濕重-干重）／濕重×100%。

5 腦組織EB定量測定 以0．5、1、2、4、6、8、10 μg／ml為伊文思藍（Evans blue，EB）標準濃度，繪制EB標準曲線。處死前1h經右側股靜脈注射2%EB（5 ml／kg），麻醉后常規灌注取腦，去除腦干、小腦稱重后，加入5倍體積的二甲基甲酰胺，60℃水浴中孵育72h，1500r／min離心10min，取上清液，用紫外分光光度計在EB最大吸收光譜620nm處測吸光度，從標準曲線上查得EB含量（μg／g），EB熒光檢測可以在主觀上判斷EB的分布及滲出情況，但是目前尚不能作為EB半定量的依據，所以本實驗僅取EB滲出高峰即24h的腦組織標本觀察EB滲出及分布情況，作為對EB定量檢測的印證：Sham組、SAH24h組和SAH24h組各取部分腦組織，濾紙吸去表面血液和水分，OCT包埋，行冰凍切片，片厚20μm，綠色激光激發，可見EB發出的紅色熒光。

6 樣本采集與測定 各組大鼠分別在規定的時間點深度麻醉后，采用生理鹽水和中性甲醛溶液灌注固定，用10%中性甲醛固定標本24h后，常規脫水、透明、石蠟包埋切片，免疫組化染色封片。用Olympus BX51圖像采集系統采集圖像，Image Pro Plus 6．0分析免疫組化染色結果。

7 統計學處理 用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件對免疫組化染色結果進行半定量分析，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），對免疫組織化學染色陽性結果用平均光密度值表示；結果以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS13．0統計軟件對結果進行統計分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結 果

1 大鼠腦含水量測定 見表1。SAH后各組大鼠腦含水量較Sham組明顯升高，SAH各組與Sham組相比有顯著性差異（P＜0．05），其中SAH后24h大鼠腦含水量達高峰。HBO24h組、72h較SAH后相應24h組、72h組大鼠腦含水量明顯下降（P＜0．05），HBO12h組與SAH12h組相比，腦組織含水量略低，但無顯著性差異（P＞0．05）。

表1 HBO對SAH后腦組織含水量的影響（±s，%）

表1 HBO對SAH后腦組織含水量的影響（±s，%）

注：＊SAH各組與Sham組比，P＜0．05；＊＊相同時間點HBO組與SAH組比，P＜0．05

12h 24h 72h Sham組組 別73．63±0．4 72．20±0．2 SAH組 73．72±0．4＊ 77．35±0．5＊ 74．86±0．4＊HBO組 73．43±0．5 76．24±0．6＊＊

2 大鼠血腦屏障通透性變化 見表2及圖1。SAH后各組腦組織EB含量較Sham組明顯升高（P＜0．05），其中SAH后24h大鼠腦組織EB含量達高峰。相同時間點HBO組與SAH組相比，大鼠腦組織EB含量顯著降低（P＜0．05）。取EB滲出最高峰—24h行熒光觀察示：Sham組在軟腦膜上可見紅色不連續帶狀熒光，在腦實質內未見紅色熒光；SAH后24h組腦組質內可見大片紅色熒光，在特別在腦血管周圍紅色熒光明顯增強，呈類圓形；HBO24h組腦組質內可見紅色點狀熒光，熒光強度、面積較SAH24h組明顯下降，結果與EB定量測定一致。

表2 HBO對SAH后血腦屏障通透性的影響（±s，μg／g）

表2 HBO對SAH后血腦屏障通透性的影響（±s，μg／g）

注：＊SAH各組與Sham組比，P＜0．05；＊＊相同時間點HBO組與SAH 組比，P＜0．05

12h 24h 72h Sham組組 別7．43±0．4 SAH組 14．58±0．6＊ 30．23±0．8＊ 16．36±0．4＊HBO組 13．03±0．5＊＊ 23．64±0．7＊＊ 14．76±0．6＊＊

圖1 各組大鼠腦組織EB熒光檢測結果（×400）

3 大鼠海馬區MMP-9測定 見表3及圖2。SAH后12h大鼠海馬區神經元細胞及膠質細胞胞漿內可見淡棕色MMP-9陽性表達顆粒，至24hMMP-9表達呈深褐色，細胞核結構消失，72h后MMP-9表達稍減弱，呈淺褐色，在相同時間點，HBO組MMP-9表達較SAH組稍減弱，Sham組海馬區僅見比背景色稍強的弱陽性表達。SAH各組與Sham組相比，MMP-9表達明顯增高（P＜0．05），在同一時間點SAH組的平均光密度較HBO組顯著增大（P＜0．05）。

表3 HBO對SAH后海馬區MMP-9表達的影響（±s，×10-3）

表3 HBO對SAH后海馬區MMP-9表達的影響（±s，×10-3）

注：＊SAH各組與Sham組比，P＜0．05；＊＊相同時間點HBO組與SAH組比，P＜0．05

12h 24h 72h Sham組組 別0．02±0．3 SAH組 2．26±0．4＊ 9．39±0．8＊ 5．39±0．7＊HBO組 1．72±0．3＊＊ 7．43±0．9＊＊ 3．93±0．8＊＊

圖2 各組大鼠海馬區MMP-9免疫組化染色結果（×400）

4 大鼠頂葉腦皮質MMP-9測定 見圖3及表4。在SAH后大鼠腦皮質MMP-9表達與海馬區表達一致，SAH各組與Sham組相比，MMP-9表達明顯增高（P＜0．05），在同一時間點SAH組的平均光密度較HBO組明顯增大（P＜0．05）。

表4 HBO對SAH后大鼠腦皮質MMP-9表達的影響（±s，×10-3）

表4 HBO對SAH后大鼠腦皮質MMP-9表達的影響（±s，×10-3）

注：＊SAH組與Sham組比，P＜0．05；＊＊相同時間點HBO組與SAH組比，P＜0．05

12h 24h 72h Sham組組 別0．03±0．3 SAH組 1．20±0．3＊ 3．33±0．6＊ 1．76±0．5＊HBO組 0．80±0．4＊＊ 2．23±0．5＊＊ 1．16±0．4＊＊

圖3 各組大鼠腦皮質MMP-9免疫組化染色結果（×400）

討 論

MMP-9屬于基質金屬蛋白酶家族，是一種鋅原子依賴性內肽酶，可以水解多種細胞外基質；BBB的主要構成部分如Ⅳ型膠原和層粘連蛋白均是可被MMP-9降解，且新近研究發現構成BBB基本結構——緊密連接也可以被 MMP-9降解［15］。Hamann和 Fujimura等研究指出MMP-9的表達升高是造成BBB損傷的因素之一，并參與了血管源性腦水腫形成［16，17］。Yang等通過應用BB-1101抑制MMP-9的表達證實可以減輕BBB緊密連接的破壞，對BBB的損傷具有保護作用［18］。因此通過直接觀測BBB的通透性和間接檢測MMP-9的表達情況能夠間接地反映出BBB的損傷狀態，是評價BBB損傷的常用指標之一。

本實驗觀察了HBO對SAH后不同時間點，大鼠腦組織的含水量、EB通透性及MMP-9的表達的影響。實驗結果顯示，SAH后腦組織含水量的變化趨勢與BBB通透性的變化趨勢一致，提示BBB通透性的升高參與了SAH后腦水腫的形成；且BBB的通透性變化趨勢與腦皮質及海馬區MMP-9的表達結果一致，提示SAH后BBB通透性升高與神經元細胞及神經膠質細胞過度合成的MMP-9通過旁分泌或內分泌途徑引起的BBB的破壞有關。HBO通過提高血氧分壓、擴張血管、增大氧的彌散距離等，改善了SAH后腦內供氧狀態，抑制了MMP-9的表達升高，減少了BBB的破壞，改善了BBB的通透性，減輕腦水腫，對SAH后BBB的損傷有保護作用。但是目前對SAH后造成BBB損傷的具體因素仍不清楚，本實驗結果提示：缺氧可能是造成SAH后BBB的原因之一；早期改善顱內的氧供水平，對SAH的治療具有積極作用。

［1］ Bederson J B，Conno lly E S，Batjer H H，etal．Guidelines for the management of aneurism al subarachnoid hemorrhage：a statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council，American Heart Association［J］．Stroke，2009，40（3）：994-1025．

［2］ Broderick JP，Brott TG，JE Duldner，etal．Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage［J］．Stroke，1994，25（7）：1342-1344．

［3］ Frykholm P，Andersson JL，Person L，etal．Haemodynamic and metabolic disturbances in the acute stage of subarachnoid haemorrhage demonstrated by PET［J］．Acta Neurol Scand，2004，109（1）：25-32．

［4］ 張 磊，黃清海，劉建民．動脈瘤破裂自發性蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷［J］．中華腦血管病雜志（電子版），2009，3（5）：248-255．

［5］ Jones SR，Carpin KM，Woodward SM，etal．Hyperbaric oxygen inhibits ischemia-reperfusion-induced neutrophil CD18polarization by a nitric oxide mechanism［J］．Plast Reconstr Surg，2010，126（2）：403-411．

［6］ Li JS，Zhang W，Kang ZM，etal．Hyperbaric oxygen preconditioning reduces ischemia-reperfusion injury by inhibition of apoptosis via mitochondrial pathway in rat brain［J］．Neuroscience，2009，159（4）：1309-1315．

［7］ 惠俊俠，白海平．高壓氧治療腦損傷98例［J］．陜西醫學雜志，2007，36（6）：761-762．

［8］ 張西安，馬康孝，劉展會，等．高壓氧對彌漫性軸索損傷大鼠腦干水腫及AQP-4表達的影響［J］．陜西醫學雜志，2013，42（2）：137-142．

［9］ Yang ZJ，Xie Y，Bosco GM，etal．Hyperbaric oxygenation alleviates MCAO-induced brain injury and reduces hydroxyl radical formation and glutamate release［J］．Eur J Appl Physiol，2010，108（3）：513-522．

［10］ Matchett GA，Martin RD，Zhang JH．Hyperbaric oxygen therapy and cerebral ischemia：neuroprotective mechanisms［J］．Neurol Res，2009，31（2）：114-121．

［11］ Kanno T，Nonomura K．Hyperbaric oxygen therapy to determine the surgical indication of moderate hypertensive intracerebral hemorrhage［J］．Minim Invasive Neurosurg，1996 ，39（2）：56-59．

［12］ Kocaogullar Y，Ustün ME，Avci E，etal．The role of hyperbaric oxygen in the management of subarachnoid hemorrhage［J］．Intensive Care Med，2004，30（1）：141-146．

［13］ Kohshi K，Yokota A，Konda N，etal．Hyperbaric oxygen therapy adjunctive to mild hypertensive hypervolemia for symptomatic vasospasm［J］．Neurol Med Chir（Tokyo），1993，33（2）：92-99．

［14］ Lee JY，Sagher O，Keep R，etal．Comparison of experimental rat models of early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］．Neurosurgery，2009，65（2）：331-343．

［15］ Yang Y，Estrada EY，Thompson JF，etal．Matrix metalloproteinase-mediated disruption of tight junction proteins in cerebral vessels is reversed by synthetic matrix metalloproteinase inhibitor in focal ischemia in rat［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2007，27（4）：697–709．

［16］ Hamann GF，Liebetrau M，Martens H，etal．Microvascular basal lamina injury after experimental focal cerebral ischemia and reperfusion in the rat［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（5）：526-533．

［17］ Fujimura M，Gasche Y，Morita-Fujimura Y，etal．Early appearance of activated matrix metalloproteinase-9and blood-brain barrier disruption in mice after focal cerebral ischemia and reperfusion［J］．Brain Res，1999 ，842（1）：92-100．

［18］ Yang Y，Estrada EY，Thompson JF，etal．Matrix metalloproteinase-mediated disruption of tight junction proteins in cerebral vessels is reversed by synthetic matrix metalloproteinase inhibitor in focal ischemia in rat［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2007，27（4）：697–709．