腦缺血再灌注后大鼠運動皮質(zhì)SIRT3的表達(dá)特點＊

西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（西安710003）

常明則 吳海琴△ 喬 琳△△ 王新來 狄政莉 劉志勤 毛 佳 田 曄▲

沉默信信調(diào)節(jié)因子（Silent mating type information regulation 2，Sir2）家族屬于第三類組蛋白去乙酰化酶，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）參與調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，在基因沉默、染色質(zhì)穩(wěn)定、雙鏈DNA斷裂損傷后生理修復(fù)以及延長細(xì)胞周期中均起著重要的作用［1］。在哺乳動物共有7個SIRT的同源基因，分別命名為SIRT1-SIRT7。沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Silent information regulator 3，SIRT3）是第一個被定位在哺乳動物細(xì)胞線粒體的NAD依賴的去乙酷化酶家族成員，廣泛存在于線粒體基質(zhì)和細(xì)胞核中，目前研究主要集中在調(diào)節(jié)代謝、防治變性疾病及抗衰老等方面，在線粒體能量生成、代謝、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用［2～4］。目前，SIRT3在缺血性腦損傷中的作用研究較少，本研究采用免疫組化技術(shù)觀察大鼠全腦缺血再灌注后大腦運動皮質(zhì)內(nèi)SIRT3的動態(tài)變化情況。

材料與方法

1 實驗材料

1．1 試劑與儀器：兔抗大鼠SIRT3單克隆抗體（SantaCruz公司），SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，JGD-RF2射頻雙極電凝器，江灣I型腦立體定位儀。

1．2 動物分組：SD大鼠42只，雌雄不拘，體重200～250g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，實驗前將動物置于實驗室適應(yīng)環(huán)境1周，自由進(jìn)食、飲水，室溫22±2℃，相對濕度65%，每天光照12 h。隨機(jī)均分為6組，即：正常對照組，腦缺血再灌注6h、24h、72h、5d和7d組，每組7只。

2 實驗方法

2．1 動物模型的建立：采用改良Pulsinelli四動脈阻斷法［5］，以20%水合氯醛0．6ml／kg腹腔內(nèi)注射麻醉，5min內(nèi)痛覺及翻正反射消失，但有角膜反射。將大鼠轉(zhuǎn)移到腦立體定位儀上，俯臥，頭向下傾斜30度固定，直視下電凝第一頸椎后弓上的橫突孔，阻斷雙側(cè)椎動脈；24h后大鼠在乙醚麻醉下仰臥固定，分離兩側(cè)頸總動脈，待大鼠清醒后，用微型動脈夾夾閉兩側(cè)頸總動脈，腦電圖變?yōu)橐黄骄€，15min后將兩個動脈夾松開行再灌注。缺血時大鼠沒有昏迷，或發(fā)生震顫、翻轉(zhuǎn)，以及再灌注時發(fā)生痙攣、癲癇，均淘汰。

2．2 取材及制片：以20%水合氯醛0．8ml／kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，快速開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈，用4%多聚甲醛灌注固定1h，開顱取腦，置于相同灌注液12h，脫水后石蠟包埋。參照大鼠立體定位圖譜［6］，用石蠟切片機(jī)自前囟后3mm處向后行冠狀位切片，片厚5μm。

2．3 免疫組化及結(jié)果判定：腦切片經(jīng)脫蠟與水化后，至于蒸餾水配置的3%H2O2中，室溫封閉15min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性，并置于0．01mol／L枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6．0）中加熱10min進(jìn)行抗原修復(fù)，正常山羊血清做為封閉液。一抗用兔抗大鼠SIRT3單克隆抗體。37 ℃ 復(fù)溫 45min，0．01mol／LPBS洗3次，每次2min。后滴加生物素化二抗，37℃恒溫孵育40min。0．01mol／L PBS洗3 次，每次2min并滴加試劑SABC，37℃恒溫孵育20min后以0．01mol／L PBS洗4次，每次5min。再滴加 DAB溶液，室溫下顯色。脫水，透明，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠大腦運動皮質(zhì)，以細(xì)胞膜出現(xiàn)鮮艷的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片高倍鏡（×400倍）下隨機(jī)選擇5個不同的視野，計數(shù)每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 本組使用SPSSl3．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

光鏡下可見SIRT3免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，胞膜染色為主，主要集中在Ⅱ及Ⅲ層，錐體細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。正常對照組可見可見散在少量SIRT3蛋白表達(dá)；每高倍視野（×400）下正常對照組、再灌注6h、再灌注24h、再灌注72h、再灌注5d及再灌注7d組的SIRT3陽性細(xì)胞個數(shù)分別為15．14＋2．11、70．71±6．13、86．57±5．03、95．71±6．05、80．71±4．39和53．14±3．80。腦缺血再灌注后各時間點組大鼠大腦運動皮質(zhì)內(nèi)SIRT3陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組增加（P＜0．01）；由6h組、24h組至72h組，大鼠大腦運動皮質(zhì)內(nèi)SIRT3陽性細(xì)胞數(shù)隨再灌注時間延長而增加（P＜0．01）；由72h組、5d組至7d組，大鼠大腦運動皮質(zhì)內(nèi)SIRT3的含量隨再灌注時間延長而減少（P＜0．01），詳見附圖。

附圖 各組大鼠運動皮質(zhì)區(qū)SIRT3蛋白表達(dá)（SABC×400）A：正常對照組；B：再灌注6h組；C：再灌注24h組；D：再灌注72h組；E：再灌注5d組；F：再灌注7d組

討 論

SIRT3是依賴于NAD＋的去乙?；傅腟irtuin家族成員之一，能對線粒體內(nèi)乙?；鞍酌撘阴；謴?fù)或改善其調(diào)節(jié)蛋白活性，通過增加ROS清除酶活性和穩(wěn)定線粒體功能來抑制線粒體內(nèi)ROS的蓄積，增強(qiáng)線粒體氧化作用及呼吸鏈功能，對于緩解和降低氧化應(yīng)激負(fù)荷具有重要意義［7］。Chen等研究證明：SIRT3能夠增強(qiáng)乙?；腻i超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性，降低線粒體內(nèi)ROS水平［8］。近期研究表明：SIRT3能夠提高線粒體中谷胱甘肽還原型／氧化型的比率及乙酰化人叉頭框蛋白O3介導(dǎo)抗氧化損傷，下調(diào)ROS水平［9］。

大鼠全腦腦缺血再灌注后，SIRT3表達(dá)和活性變化有明顯的動態(tài)時間分布特點。本研究通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)在全腦缺血再灌注后大鼠大腦運動皮質(zhì)內(nèi)SIRT3的表達(dá)隨再灌注時間延長呈拋物線式變化規(guī)律。正常對照組僅可見少量SIRT3蛋白表達(dá)，而再灌注后6h組、24h組至72h組，隨再灌注時間延長SIRT3表達(dá)增加；由72h組、5d組至7d組，SIRT3表達(dá)隨再灌注時間延長而減少。腦缺血后炎癥啟動于急性期，發(fā)展于亞急性期，并影響到慢性期的恢復(fù)，全腦缺血再灌注后急性期（數(shù)小時內(nèi)），主要由于能量代謝障礙、離子平衡失調(diào)、興奮性氨基酸毒性、自由基產(chǎn)生增加等變化，導(dǎo)致神經(jīng)元急性損傷；亞急性期（數(shù)小時至數(shù)天），發(fā)展為炎癥、細(xì)胞凋亡為主的變化［10～11］，72h內(nèi)的急性期及亞急性期內(nèi)，SIRT3表達(dá)在可能伴隨著炎癥反應(yīng)啟動、活躍及細(xì)胞凋亡等，而慢性期表現(xiàn)為血管新生、神經(jīng)元及其突觸再生過程中伴隨SIRT3表達(dá)的下降，可能與炎癥反應(yīng)后激發(fā)的腦保護(hù)機(jī)制相關(guān)。提示SIRT3可能參與腦缺血再灌注損傷后動態(tài)病理生理過程。細(xì)胞凋亡存在兩種凋亡途徑：外部途徑和內(nèi)部途徑，外部途徑又稱之為凋亡受體途徑，其始于死亡配體與細(xì)胞表面同族的受體相結(jié)合；內(nèi)部途徑也可稱之為線粒體途徑由許多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的刺激引起。于竹芹等研究表明：大鼠腦缺血再灌注后6h海馬區(qū)凋亡神經(jīng)元逐漸增多至再灌注7d凋亡神經(jīng)元達(dá)峰值，隨后至再灌注28d顯著降低［12］，與本研究中腦缺血再灌注后SIRT3時項動態(tài)變化的時項規(guī)律接近，提示SIRT3可能與腦缺血再灌注后凋亡的發(fā)生相關(guān)。

因此，我們設(shè)想，SIRT3通過調(diào)節(jié)線粒體ROS水平參與全腦缺血再灌注損傷后凋亡的內(nèi)部途徑機(jī)制，但其在全腦缺血再灌注損傷中扮演的具體的角色等有待進(jìn)一步研究。

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