星點設計-效應面法優化顯齒蛇葡萄提取工藝*

蘇素嬌 謝勇 李娜 楊先鋒 梁一池

（福建中醫藥大學藥學院 福州350122）

顯齒蛇葡萄系葡萄科蛇葡萄屬植物（Ampelopsis grossedentata＜Hand-Mazz＞W.T.Wang），主要分布在福建、廣東、湖南等省區。其味甘、淡，性涼，具有清熱解毒、利濕消腫等功效，主治黃疸型肝炎、感冒風熱、咽喉腫痛、目赤腫痛、癰腫瘡癤等[1]。國內采用正交旋轉設計或均勻設計來優化顯齒蛇葡萄總黃酮的提取工藝，這兩種方法采用線性數學模型，具有簡便、試驗次數少等優點，但精度不高[2～5]。我們以顯齒蛇葡萄總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素為評價指標，研究超聲提取中乙醇體積分數、提取時間、溶媒比對顯齒蛇葡萄各指標的影響，并用星點設計-效應面法優化其提取工藝，為顯齒蛇葡萄的有效利用及開發提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-9100紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；THC-10B數控超聲波提取器（濟寧天華超聲電子儀器有限公司）；AR2130電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；DFYDHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（HPLC）包括四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、2998PDA檢測器，Empower3工作站（美國Waters公司）；Sartorius CP225D電子天平（德國Sartorius公司）；Millipore超純水機（法國Millipore公司）。

1.2 試藥 二氫楊梅素對照品（批號：12013108）、楊梅素（批號：12013108）、楊梅苷（批號：12013108），水為重蒸水，其它試劑為分析純。顯齒蛇葡萄藥材采于福建省高新技術產業園顯齒蛇葡萄基地，由福建中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室范世明高級實驗師鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata＜Hand-Mazz＞W.T.Wang）。藥材于40℃下干燥至恒重，粉碎過40目篩，備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱UltimateXB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）；梯度洗脫，0～50 min，10%～20%A，50～75 min，20%～30%A。流速0.8 mL/min，檢測波長365 nm，柱溫40℃，進樣量 10 μL。

2.2 對照品及供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素對照品適量于10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解，稀釋至刻度，分別配制成濃度為7.944 mg/mL、1.009 mg/mL和0.997 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量，用無水乙醇制成每1 mL對照品溶液含二氫楊梅素3.972 mg、楊梅苷0.1009 mg、楊梅素0.0499 mg的混合對照品溶液，放置4℃冰箱儲存備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取顯齒蛇葡萄粉末0.5 g，于100 mL錐形瓶中，量取60%的乙醇溶液15 mL，稱定重量，浸泡30 min后，超聲提取30 min，稱重，補足失重。取上層清液1 mL定容至10 mL即得。

2.3 標準曲線繪制

2.3.1 紫外測定總黃酮標準曲線繪制 取對照品溶液 0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、2.0 mL 于 25 mL 瓶中，加1%AlCl3溶液4 mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，反應10 min，以30%乙醇溶液為空白，在310 nm處測定吸光度值，以對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程：Y=52.92X-0.0026，r=0.9999，結果表明二氫楊梅素在4.84～16.13 μg/mL內具有良好的線性關系。

2.3.2 二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素的標準曲線繪制 精密吸取“2.2.1”項的混合對照品溶液1、2、4、8、12、15 μL，分別按照“2.1”項的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程，得二氫楊梅素的回歸方程為：Y=80532X+44994，r=0.9998；得楊梅苷的回歸方程為：Y=2×106X+21700，r=0.9999；得楊梅素的回歸方程為：Y=4×106X+12996，r=0.9999；結果表明二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素分別在3.972～59.580 μg、0.101～1.514 μg、0.050～0.748 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.4 星點設計 在單因素試驗考察的基礎上，確定超聲提取的考察因素為乙醇體積分數、提取時間、溶媒比，進一步采用星點設計-效應面法優化提取工藝，因提取次數為非連續變量，回歸處理比較困難，暫定為1次。根據星點設計的原理，每個因素設5個水平，用代碼 -α、-1、0、1、α 來表示（3 因素星點設計的α=1.682），代碼所代表的實際操作物理量見表1，星點實驗設計及結果見表2。

表1 星點設計實驗因素水平

表2 星點實驗設計及結果 mg/g

2.5 模型擬合 應用Design-Expert8.0.4軟件對所得數據進行效應面試驗分析，以總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素四者的總體歸一值（OD）為評價指標[6]，分別對各因素進行多元線性回歸及二項式方程擬合。多元線性回歸方程：OD=0.69+0.16A+0.19B+0.002C（r=0.6273）；二項式擬合方程：OD=0.85+0.16A+0.19B+0.002C-0.09AB+0.03AC+0.05 BC-0.103A2-0.09B2-0.04C2（r=0.8822）。從擬合方程的相關系數可見，多元線性回歸方程的相關系數較低（r=0.6273），表示自變量與因變量之間線性相關性較差，多元線性回歸擬合度不佳，預測性較差，因此該數學模型不合適。多元二項式擬合方程相關系數較高，擬合效果較好。方程從整體上反映了各因素及其相互作用對指標值的影響。

2.6 方差分析 采用ANOVA分析效應面的回歸參數，由表3可知一次項A、B極顯著，C顯著，二次項A、B極顯著水平，交互項等其余項均不顯著，說明各個具體試驗因素與響應值都不是簡單的線性關系。此外，還可以看出各因素對OD值影響的大小順序為：溶媒比（B）＞乙醇濃度（A）＞提取時間（C）。本試驗選用的模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明未知因素對實驗結果干擾很小，二項式擬合模型為成功模型，實測值與預測值基本吻合，有較好的預測作用。

表3 擬合回歸方程的方差分析

2.7 工藝條件優化與預測 根據二次多項式模型，繪制各考察因素與總體歸一值（OD）之間的等高線圖與三維效應曲面圖。根據各因素水平設定各因素自變量區間，效應值選擇極大值，得到最佳提取工藝條件：乙醇體積分數65.82%，溶媒倍量33.88倍，提取時間32.61 min，此時OD有最大預測值0.9814。考慮到實際生產情況，將各因素條件取整確定顯齒蛇葡萄總黃酮最佳提取工藝條件：30倍量65%乙醇超聲提取1次，提取時間為30 min。

2.8 驗證試驗 按上述優化后的最佳工藝條件提取并測定顯齒蛇葡萄中總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素的含量，并且進行總體歸一化處理，得到平均OD值為0.9762，RSD為1.67%，預測值為0.9814。結果表明，所建立的數學模型具有良好的預測性，所選工藝條件重現性好。

3 討論

本實驗采用超聲提取法提取顯齒蛇葡萄總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素，結果表明：最佳提取工藝條件為30倍量65%乙醇超聲提取1次，提取時間為30 min。此條件下，得到各指標成分的含量經總體歸一化處理后得到的的OD值為0.9762。采用非線性擬合的星點設計-效應面法擬合得出最佳條件，可以很好地解決傳統正交設計的不足，從而提高優化效果。此法與傳統方法相比較，具有節約、操作簡單、省時等優點，得率也高，在中藥提取中具有良好的應用前景。

[1]國家中醫藥管理局編委會.中華本草[M].第13卷.上海：上海科學技術出版社，1998.4 229

[2]陳業，羅祖友，向東山.藤茶黃酮類化合物的提取分離與定量方法研究進展[J].湖北民族學院學報(自然科學版)，2008，26(3)：277-281

[3]剛振坤，馬英麗，吳倫，等.星點設計-效應面法優化北五味子果實提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(23)：28-31

[4]劉艷杰，項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用[J].中國現代應用藥學雜志，2007，24(6)：455-457

[5]吳偉，崔光華，陸彬.實驗設計中多指標的優化：星點設計和總評"歸一值 " 的應用[J].中國藥學雜志，2000，35(8)：530-533

[6]盧君蓉，傅超美，劉芳，等.星點設計-效應面法優選丹參中丹參總酚酸的提取工藝[J].中成藥，2012，34(7)：1 373-1 376