補陽還五湯對大鼠斷肢再植術后肢體缺血再灌注損傷的影響*

張輝 袁治國 邵建軍

（甘肅省第二人民醫院骨科 蘭州730000）

斷肢（指）再植是指失去血液供應的離斷肢體，通過手外科與顯微外科手術重建其血液循環使肢（指）體獲得再生的手術[1]。斷肢再植術后常可引起肢體缺血-再灌注損傷[2]，如何減輕肢體缺血再灌注的損傷，降低肢體缺血再灌注后的致殘率和死亡率逐漸成為研究的熱點，而中藥對肢體缺血-再灌注損傷保護作用的研究也愈來愈受到重視。本研究以名方補陽還五湯為基礎，建立大鼠下肢斷肢再植術后缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injure，IRI）動物模型，再灌注即刻給予補陽還五湯灌胃，初步探討補陽還五湯對大鼠下肢缺血-再灌注損傷中的影響，評估其對缺血組織的保護作用及機制，為進一步開展臨床上應用補陽還五湯防治肢體缺血-再灌注損傷奠定基礎。現報道如下：

1 材料

1.1 實驗動物 成年健康清潔級SD大鼠，雄性，體重250～320 g，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK2012-0106-0001418。

1.2 藥品與試劑 補陽還五湯（甘肅省第二人民醫院藥劑科配置）；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所生產，批號：20070605、20070606、20071228）；戊巴比妥鈉粉劑（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20060401）；M-MLv 逆轉錄酶（Promega公司提供）；Trizol試劑、耐熱 DNA聚合酶及DNAMaker（天根生化科技〈北京〉有限公司提供）；PCR引物（武漢博士德生物工程有限公司提供）。

1.3 主要儀器 SpectraMax190酶標儀，Molecular Devices，美國；TDZ4-WS低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；756MC紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；FA1004天平（上海精科天平廠）；原子吸收分光光度計（北京瑞利分析儀器公司，型號：UV-9100）；低溫高速離心機（eppendorf公司，5415R型）；光學顯微鏡、攝像頭（Olympus BX41，SPOT-CCD，diagnostic公司）；透射電鏡（荷蘭菲利浦，TECNAL-10）；PCR擴增儀（eppendorf公司出品）；Versa Doc 5000Mp成像系統（BIO-RAD公司出品）。

2 方法

2.1 肢體缺血-再灌注損傷動物模型的建立 健康Wistar大鼠術前常規禁食12 h，自由飲水。3%戊巴比妥鈉（事先用蒸餾水和戊巴比妥鈉粉劑配制）30 mg/kg腹腔內注射麻醉，將大鼠仰臥固定于操作臺上，在后肢股三角處剪毛，于腹股溝處沿血管走行縱行切開皮膚、皮下組織，鈍性分離縫匠肌后部，游離股動脈、股靜脈和股神經，迅速切斷動、靜脈，在股動、靜脈近端分別用動、靜脈夾夾閉，并用張力帶于股鞘下環綁扎肢體阻斷側支循環。4|h后行血管吻合，斷肢再植，恢復血流灌注4 h，后肢顏色恢復紅潤，制成缺血-再灌注模型。

2.2 動物分組及給藥 健康Wistar大鼠120只，隨機分為四組，每組30只：（1）正常對照組（A組），僅麻醉及生理鹽水灌胃；（2）補陽還五湯組（B組），缺血4 h后行血管吻合，斷肢再植，補陽還五湯灌胃；（3）依達拉奉組（C組），缺血4 h后行血管吻合，斷肢再植，血栓通注射液灌胃；（4）空白對照組（D組），缺血4 h后行血管吻合，斷肢再植，生理鹽水灌胃。

2.3 指標的測定 （1）血液標本的采集：每組選10只造模成功的大鼠，分別于再灌注4 h后處死，做中下腹正中切口，暴露下腔靜脈用皮試針頭穿刺，自下腔靜脈取靜脈血約2～3 mL，分離血清，測定血清中MPO、LDH、tNOS、iNOS、cNOS、SOD 的 活 性 和MDA、NO及Ca2+的含量。（2）腓腸肌標本的采集：每組大鼠分別取后肢腓腸肌組織后取約200 mg入凍存管低溫保存，測Ca2+負載；約200 mg胖腸肌組織用冰生理鹽水沖洗后低溫保存經后續處理，測SOD活性及MDA濃度；50～100 mg入經DEPC水處理并滅菌的凍存管放入液氮中保存，做RT-PCR。每只大鼠順肌纖維方向切下大小約為0.1 cm×0.1 cm×0.3 cm的肌肉標本2～3塊，用牙簽小心移入裝有預冷2.5%戊二醛的標本瓶內，4℃冷藏，經后續處理后透射電鏡觀察。余下部分用10%中性多聚甲醛固定，經后續處理后普通光鏡觀察。（3）腓腸肌組織提取總RNA，采用RT-PCR半定量分析Bcl-2 mRNA和Bax-mRNA轉錄水平。（4）通過石蠟切片及HE染色、電鏡觀察腓腸肌組織形態學變化。

2.4 統計學處理 以SPSS15.0統計軟件包進行統計分析，所有數據均以（±S）表示，組間樣本均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著統計學意義。

3 結果

3.1 肢體成活情況 再灌注1周后，觀察再植術后肢體成活情況。補陽還五湯組20只大鼠，肢體全部成活，成活率100%；空白對照組20只大鼠，術后有6只大鼠逐漸出現肢體壞死，成活14只，成活率70%；提示補陽還五湯組肢體成活率明顯增高（P＜0.01）。依達拉奉組成活18只，成活率90%，與補陽還五湯組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.2 血清 MPO、LDH 和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指標變化 再灌注4 h后，與正常組比較，補陽還五湯組、依達拉奉組血清中MPO、LDH、tNOS、iNOS的活性均增高（P＜0.01），空白對照組中血清中cNOS活性降低（P＜0.05），補陽還五湯組血清中cNOS活性增高（P＜0.05）。與空白對照組相比較，補陽還五湯組血清中 MPO、LDH、iNOS活性均降低（P＜0.05），tNOS、cNOS 活性增高（P＜0.05）。見表1。

表1 血清MPO、LDH和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指標變化比較 （±S） （U/L）

表1 血清MPO、LDH和 NOS（tNOS、iNOS、cNOS）指標變化比較 （±S） （U/L）

注：與 A 組比較，*P＜0.01，△P＜0.05；與 D 組比較，#P＜0.05。

組別 MPO LDH tNOS iNOS cNOS A組B組C組D組47.56±4.24 70.13±7.28*#113.23±6.12*213.59±5.18 3 548.87±239.16 4 602.18±342.13*#5 261.87±142.24*6 128.71±428.13 21.18±5.32 30.12±4.28*#29.32±6.15*23.49±4.58 7.26±2.01 8.96±1.12*#10.21±3.21*13.17±1.30 13.73±2.87 19.41±2.94△#20.17±3.21△#10.32±4.82△

3.3 各組SOD、NO、MDA、Ca2+濃度測定 下肢再植術后4 h，與空白對照組相比，其余三組血清中SOD活性、NO、MDA含量均明顯降低（P＜0.01），鈣負載水平較低（P＜0.01）。與C組相比，補陽還五湯組能有效降低血清中SOD、NO、Ca2+含量，MDA含量差別無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組SOD、NO、MDA、Ca2+濃度比較 （±S）

表2 各組SOD、NO、MDA、Ca2+濃度比較 （±S）

注：與D組比較，*P＜0.01；與C組比較，#P＜0.05。

組別SOD（U/mg）NO（μmol/L）MDA（nmol/g）Ca2+（mg/kg）A組B組C組D組1.08±0.1*1.60±0.2*#1.65±0.4*1.96±0.8 21.04±5.4*68.92±16.3*#76.51±11.2*108.84±14.1 23.33±6.2*53.22±9.4*53.19±6.8*97.31±19.6 8.26±1.6*158.46±18.2 164.19±13.2 211.33±53.4*#*

3.4 RT-PCR結果 肢體缺血可導致骨骼肌Bcl-2基因表達、Bcl-2/Bax的比值降低，Bax基因表達增高；再灌注后Bcl-2基因表達、Bcl-2/Bax的比值進一步降低，Bax基因表達進一步增高；應用補陽還五湯后，Bcl-2基因表達、Bcl-2/Bax的比值與對照組比明顯增加，Bax基因表達與對照組比則明顯下降。見表3。

表3 Bcl-2、Bax、β-actin基因RT-PCR產物電泳條帶光強度值比值比較 （±S）

表3 Bcl-2、Bax、β-actin基因RT-PCR產物電泳條帶光強度值比值比較 （±S）

項目 A組 B組 C組 D組Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/Bax 1.8171±0.0638 1.2143±0.0451 1.4964±0.0312 1.6536±0.0102 1.6788±0.1004 0.9850±0.0120 1.7453±0.0115 1.6963±0.0378 1.0289±0.0415 0.8918±0.1102 2.8358±0.2172 0.3145±0.0072

3.5 大鼠下肢缺血再灌注4 h后骨骼肌HE染色光鏡下結構的變化 正常的骨骼肌肌纖維粗細均勻，排列整齊；缺血后肌纖維水腫，排列不整齊，部分溶解，并可見有少量白細胞與紅細胞滲出；再灌注后肌纖維出現水腫變性、斷裂甚至溶解，肌細胞嚴重破壞，斷裂肌纖維間有大量白細胞和紅細胞浸潤；給藥后缺血再灌注組骨骼肌水腫明顯減輕，肌纖維變性較對照組為輕，炎性細胞浸潤不明顯。

4 討論

各種原因造成的肢體缺血是血管外科和創傷外科常見的病理生理過程，恢復缺血肢體的血液供應是肢體得以存活和保持功能的關鍵，但缺血組織再灌注又可導致缺血組織的進一步損傷，稱為缺血-再灌注損傷[3～4]。組織損傷可進一步引發遠隔器官的損傷，進一步發展可演變成全身炎性反應綜合征，甚至多器官功能衰竭，危及生命。缺血-再灌注損傷的概念最早由Mccord[5]于1985提出，到目前為止，學者們已經在多種組織、器官中發現再灌注損傷的存在[6～7]。如何能消除再灌注損傷，進一步減少組織損傷、保護細胞功能和避免缺血壞死區擴大已經越來越引起學者們的關注。

補陽還五湯始載于《醫林改錯》，由王清任所創，大補元氣兼以活血，使虧損之五成元氣恢復，是謂“還五”，而陽氣重新周行全身回復“十全”，故王氏稱此方為“補陽還五湯”[8]。方由黃芪、當歸、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍7味組成，本方各藥合用，使氣足以推動血行，瘀去絡通，則筋肉得養，痿廢可愈。現代醫學研究表明[9]，本方功能廣泛，可抑制血小板聚集、抗血栓形成或溶血栓；擴張血管、增加血流量；改善血液流變性和微循環；增加心肌營養性并有強心作用；對急性缺血損傷有預防作用；對神經損傷有修復作用；可降血脂和抑制動脈粥樣硬化斑塊形成；耐缺氧和抗疲勞、抗炎并可提高免疫功能。

氧自由基主要是指超氧陰離子（O2-）和羥自由基（OH-）。多數學者認為氧自由基是造成缺血-再灌注損傷的重要因素，認為氧自由基是缺血再灌注損傷的重要發病環節[10]。氧自由基對細胞的主要損害是造成脂質過氧化，其代謝產物為MDA，通過測定MDA的含量，能夠反映氧自由基的代謝及脂質過氧化對機體的損傷程度。NO本身就是一種自由基性質的物質，在再灌注損傷中，由于細胞內鈣超載，可激活一氧化氮合酶（NOS），使NO增加，NO與O2反應生成NO2，可使SOD的酪氨酸硝基化，從而使缺血后細胞潰變[11]。缺血時ATP生成減少，細胞Na+-Ca2+交換增加，再灌后恢復了能量供應和ATP值，促進Na+-Ca2+交換，使細胞外鈣大量內流，造成細胞內鈣超載，Ca2+濃度升高可激活多種磷脂酶，促進蛋白質分解酶合成增加、血小板活化因子合成增加；激活磷脂酶促進膜磷脂的分解，破壞細胞和線粒體膜及促進氧自由基形成，造成細胞嚴重損傷[12]。當肢體缺血達到一定程度，骨胳肌細胞受到損傷，細胞水腫，細胞膜通透性增高，細胞內含有的大量LDH入血，因而血中LDH活性變化可作為缺血后骨骼肌損傷的指標[13]。Bcl-2和Bax對細胞凋亡的調控，不僅取決于自身表達水平的高低，還與Bcl-2/Bax的比值有關，比值增加，細胞趨于存活，反之則導致細胞凋亡[14]。依達拉奉是一種作用機理明確的新型的自由基清除劑[15]，主要通過提供電子直接清除羥自由基（OH-），抑制自由基的生成及細胞膜過氧化連鎖反應，有效地抑制氧自由基對機體造成的損傷，抑制細胞凋亡。依達拉奉在缺血再灌注早期通過清除過多的羥自由基，有效地提高SOD的活性，降低MDA、MPO。抑制血管內細胞遭受氧自由基的損傷，減輕血管通透性，減少間質水腫、間質血管擴張以及炎性細胞因子的釋放，從而保護肌組織灌注正常和軟骨組織未發生退行性改變[16]。

本課題以依達拉奉作為對照組，研究結果表明：補陽還五湯能有效降低肢體缺血-再灌注后氧自由基產生，增強SOD活性，減輕有鈣超載所導致肢體缺血-再灌注損傷；能夠減少血漿NO的生成；改善微循環，擴張血管，抗血小板聚集，抗血栓形成；降低鈣超載，減輕內皮細胞損害。顯著改善大鼠缺血再灌注后肢體修復狀況，并明顯提高斷肢再植成活率，抑制大鼠血清LDH活性的升高，減少血清MDA水平。通過增強抗凋亡基因Bcl-2的表達和減弱促凋亡基因Bax表達來抑制肢體缺血再灌注后骨骼肌細胞的凋亡，減輕肢體缺血-再灌注損傷。光鏡下觀察肢體缺血再灌注后骨骼肌HE圖像，可以看到骨骼肌組織在缺血后出現肌纖維水腫，炎性細胞浸潤；再灌注后組織水腫加重，大量的炎性細胞浸潤，出現肌纖維斷裂、變性、溶解；而經補陽還五湯處理后的骨骼肌圖像肌纖維水腫、變性、炎性細胞浸潤都相對缺血組和再灌注組減輕。透射電鏡結果可見，肢體在缺血和再灌注后，肌纖維細胞凋亡程度逐漸加重，而給藥后肌纖維細胞凋亡均較對照組為輕，這也支持Bcl-2、Bax基因RT-PCR的結果，說明補陽還五湯能夠改善肢體缺血再灌注后骨骼肌損傷程度。

綜上所述，補陽還五湯對大鼠斷肢再植術后肢體缺血-再灌注損傷具有明顯的保護作用，通過抗氧化、清除自由基、抑制骨骼肌細胞凋亡來達到對缺血再灌注后損傷骨骼肌的改善保護作用。本課題的不足在于目前尚無療效確切的單味西藥作為臨床對照；沒有對再植術后成活肢體的功能進行評定，補陽還五湯在術后肢體功能重建中的保護、修復作用尚需進一步研究。

[1]任舉山，石海英，魏飛，等.復雜斷肢(指)再植的治療[J].實用手外科雜志，2012，26(4)：378-379

[2]黃慕康，于仲嘉.對斷肢(指)再植苦干問題的討論[J].中華顯微外科雜志，1994，17(1)：48-67

[3]劉向前，鄒親朋，馮勝，等.五加苷對大鼠腦梗死的保護作用[J].藥物評價研究，2010，33(2)：95-97

[4]何志，仇樹林.丹參對皮瓣缺血再灌注損傷的影響及機制[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(53)：10 021-10 025

[5]McCord JM.Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury[J].N Engl J Med，1985，312(3)：159-163

[6]Sewell WH，Koth DR，Huggins CE.Ventricular fibrillation in dogs after sudden return of flow to the coronary artery[J].Surgery，1955，38(6)：1 050-1 053

[7]Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al.Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog[J].Arch Pathol，1960，70(7)：68-78

[8]李翠勤，黃仲海.補陽還五湯在中老年慢性病中的應用[J].求醫問藥(學術版)，2011，9(6)：109-110

[9]王曉霞，李榮亨.補陽還五湯作用機制研究進展[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2008，6(5)：574-576

[10]金惠銘.病理生理學(第5版)[M].北京：人民衛生出版社，2000.110-117

[11]Carden DL，Granger DN.Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury[J].J Pathol，2000，190(3)：255-266

[12]Wang LF，Zhang HY.A theoretical investigation on DPPH radical-scavenging mechanism of edaravone [J].Bioorg Med Chem Lett，2003，13(21)：3 789-3 792

[13]Rajesh KG，Sasaguri S，Suzuki R.Antioxidant MCI-186 inhibits mitochondrial permeability transition pore and upregulates Bcl-2 expression[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(5)：H2 171-2 178

[14]Jaeschke H.Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning [J].Am J Physiol Gastrointest liver Physiol，2003，284(1)：G15-G26

[15]Kato R，Foex P.Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury：an update for anesthesiologists[J].Can J Anaesth，2002，49(8)：777-791

[16]Harkin DW，D'sa AA，Yassin MM，et al.Reperfusion injury is greater with delayed restoration of venous outflow in concurrent arterial and venous limb injury[J].Br J Surg，2000，87(6)：734-741