WY14643 對附植前小鼠胚胎體外發育及活性氧的影響

胡德寶， 莊利利， 張日欣， 張 也， 李鐘淑， 方南洙

(延邊大學農學院，動物遺傳育種與繁殖實驗室，吉林 延吉133002)

隨著體細胞克隆以及轉基因技術等生物工程的不斷發展，對體外發育的卵母細胞以及早期胚胎的需求逐漸增多。早期胚胎的體外培養，一直是細胞工程研究中的一個重點項目，對于它的研究有利于更加直觀地了解細胞，并且能提供優良的試驗材料。目前學術界正面臨克隆胚胎效率低的難題，一個重要原因就是體外培養體系的不完善引起氧化應激現象發生，導致胚胎發育阻滯，所以建立一套完善的早期胚胎體外培養體系是非常必要的。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是細胞內部由于新陳代謝作用發生氧化還原反應生成很多自由基，生成的自由基包括超氧陰離子自由基(O2·-)、羥自由基(HOˉ)、一氧化氮(NOˉ)、過氧化氫(H2O2)等，在各種哺乳動物的卵母細胞和早期胚胎發育的過程中，各種代謝和培養環境中都有可能產生過量ROS［1］導致氧化應激現象發生，引起細胞DNA、脂質及蛋白質的損傷［2］，甚者產生細胞碎片［3］，嚴重阻礙早期胚胎的體外發育。

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)是核受體家族中的配體激活受體，與過氧化物酶體的增值等功能有著緊密的聯系，它包括α、β 和γ 3 種形式亞型，PPARs 在大多數細胞中都有所表達，尤其是在腎臟和心肌細胞中表達，同時具有非常重要的生物學作用，不同的亞基其生物學功能不同［4］。WY14643 是人工合成的過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)特異性受體激活劑，國內外研究表明WY14643 在體內能夠起到降低血糖濃度、抗細胞衰老和抵抗氧化等作用［5-6］。WY14643 激活PPARα 后，PPARα 通過和視黃素X 受體結合形成異二聚體物質，這個異二聚體物和位于抗氧化靶基因特異性啟動子區域的DNA 序列相結合，通過構象變化調控抗氧化酶的活性［7］。Okaya 等［8］在肺損傷模型中的研究發現，WY14643 能夠有效克服氧化應激反應，降低氧化損傷。另有研究報道，PPARα 特異性的激動劑還能夠刺激內皮上的細胞產生許多自由基，通過活性氧第二信使的作用刺激各種抗氧化物酶的活性升高［9］。

綜上所述，小鼠早期胚胎在體外發育過程中會受到內外各種活性氧的損傷并且容易引起發育阻滯現象。在肝臟中的研究結果表明，WY14643具有有效的抗炎抗氧化的作用，但它對附植前胚胎的作用研究甚少，本試驗擬對此進行研究，旨在為更好地研究哺乳動物抗氧化機理和體外培養體系提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

昆明白系小鼠，8 ～10 周齡，購自延邊大學實驗動物中心。

1.2 試驗試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)購自寧波激素有限公司;其他相關藥品非特殊說明均購自Sigma 公司;倒置顯微鏡(Nikon TMS);二氧化碳培養箱(TC2323);熒光顯微鏡NU-425-600E。

1.3 試驗方法

1.3.1 胚胎的收集、處理和培養 挑選健康的雌性小鼠，每只供試小鼠于第1 d 18 ∶00 時腹腔注射10 IU 的PMSG，時隔48 h 腹腔內注射10 IU 的hCG，然后與公鼠合籠，公母數量比為1 ∶1，合籠12 h 后檢查小鼠陰道栓。對于脫頸處死注射hCG 24 h 后的見栓小鼠，打開腹腔取出輸卵管放置M2 中，在顯微鏡下挑破輸卵管壺腹部，用透明質酸酶(300 mg/L)脫去合子周圍的卵丘細胞，2 min 后用M2 清洗2 ～3遍，然后將收集好的無卵丘細胞的合子期胚胎分別放入之前做好的不同藥物濃度的50 μl 的小滴中(每小滴10 枚)清洗2 遍，再轉移到相應培養液中，在飽和濕度、5% CO2氣相條件、37 ℃的培養箱中培養一定時間，之后換成M16 培養液孵育。每24 h 換液，每12 h 觀察胚胎發育情況。

1.3.2 胚胎內部ROS 含量檢測 取20 枚胚胎，置于1 mg/ml PVA 小滴中洗滌2 遍，然后避光置于10 μmol/L 2'7'二氯熒光素二乙酸鹽(DCHFDA)染色液微滴中，放入培養箱孵育15 min。將孵育后的胚胎沖洗干凈，在熒光顯微鏡下熒光顯色。用Imageproplus 6.0 對熒光圖片量化分析，結果用平均相對熒光強度相對值表示。

1.4 試驗設計

分以下步驟:(1)合子期胚胎于0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L H2O2中孵育30 min，篩選引起氧化應激的最低致死濃度。(2)合子期胚胎于0 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、5.0 μmol/L WY14643 中孵育2 h，觀察胚胎發育情況，確定WY14643 促進胚胎發育最適濃度。(3)最低致死濃度H2O2與最適濃度WY14643 聯合處理，觀察與對照組(M16 培養液)、最低致死濃度的H2O2組(A 組)、最適濃度WY14643 組(B 組)以及聯合處理組(C 組)之間發育率的差異情況。(4)DCHFDA 熒光檢測上一步驟中對照組、A 組、B 組、C 組中H2O2水平，觀察WY14643 對H2O2的影響和各時期的變化情況。

1.5 統計分析

2-細胞早期胚胎發育率、4-細胞期胚胎發育率及囊胚率分別為2-細胞期胚胎、4-細胞期胚胎和囊胚與合子數的百分比。應用SPSS 17.0 進行數據差異顯著性分析。每組試驗重復數＞3 次。

2 結果

2.1 外源H2O2 對小鼠合子發育的影響

由表1 可以看出，用不同濃度的H2O2處理胚胎30 min 后，隨后放入新的M16 中繼續培養到72 h，胚胎發育率顯著不同。50 μmol/L H2O2組胚胎無法發育到囊胚階段;25 μmol/L 與0 μmol/L、10 μmol/L 組相比顯著降低了4-細胞發育率和囊胚發育率(P＜0.05);0 μmol/L、10 μmol/L 組之間差異不顯著(P＞0.05)。認為25 μmol/L H2O2為引起氧化應激導致胚胎發育受阻的最小致死濃度。

表1 外源H2O2 對小鼠合子發育的影響Table 1 Effect of exogenous H2O2 on development of mouse zygotes

2.2 WY14643 對小鼠合子發育的影響

WY14643 作為一種待研究的抗氧化藥物，其不同濃度對合子發育影響見表2。可以看出，卵裂率是各組之間無顯著性差異(P＞0.05);4-細胞發育率是0.1μmol/L WY14643 組顯著高于0 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L 組(P＜0.05)，其余各組之間差異不顯著(P＞0.05);囊胚發育率是0.1 μmol/L組顯著高于0 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L組(P＜0.05)，1.0 μmol/L 組顯著高于0、5 μmol/L組(P＜0.05)。認為0.1 μmol/L WY14643 對于合子的發育效果最好。

表2 WY14643 對小鼠合子發育的影響Table 2 Effect of WY14643 on development of mousezygotes

2.3 WY14643 對H2O2 刺激后的小鼠胚胎作用

由H2O2誘導氧化應激的小鼠胚胎，再經過最適濃度的WY14643 處理2 h 后，胚胎發育結果見表3。在H2O2中添加WY14643 的B 組中卵裂率、4-細胞發育率、囊胚發育率顯著高于單獨使用H2O2的A組(P＜0.05)，同時B 組中各階段發育率均高于對照組(M16 培養液)，但差異不顯著(P＞0.05)。

表3 WY14643 對H2O2 刺激后的小鼠胚胎作用Table 3 Effect of WY14643 on development of mousezygotes by H2 O2 induced ROS

2.4 胚胎內部H2O2 的檢測

收集各處理不同發育階段胚胎避光DCHFDA染色，藍色波長光(535 nm)激發，熒光圖片量化分析見圖1。可以看出，單獨H2O2作用的A 組，其H2O2水平顯著高于其他各組，而單獨WY14643 作用的D 組顯著降低H2O2水平(P＜0.05);聯合處理的B 組也在一定程度上降低了H2O2水平，并且顯著低于A 組(P＜0.05)，說明WY14643 能引起H2O2水平的下降。從圖1 還可以看出，胚胎內部H2O2水平在4-細胞時期達到最高，囊胚時期低于其他各時期。

圖1 不同處理組胚胎內部H2O2 的含量比較Fig.1 Comparison of H2O2 content in embryo among different treatments

3 討論

3.1 H2O2 對附植前小鼠胚胎體外發育的影響

哺乳動物的早期胚胎幾乎都存在體外發育阻滯現象，而ROS 可能是對胚胎體外發育不利的因素之一。Legge 等［10］研究結果發現高濃度ROS 能抑制正常細胞分裂，并且影響母型到合子型基因調控轉換。本試驗結果表明，經過一定濃度的外源性H2O2處理合子期胚胎后，胚胎的發育能力明顯下降，這與Al-Gubory 等［11］研究結果相似，說明H2O2濃度過高能引起細胞胚胎發生氧化損傷，導致胚胎內部出現代謝紊亂，產生氧化應激，使早期胚胎發育阻滯。

3.2 WY14643 對附植前小鼠胚胎發育及胚胎內部ROS 水平的影響

WY14643 作為PPARα 的一種特異性激動劑，現已研究證實，PPARα 與氧化應激有著密切的關系，而且過氧化氫酶(CAT)也被證實是PPARα 的靶酶［12］，WY14643 通過對抗氧化酶的調控來降低細胞內ROS 水平減少氧化應激反應。超氧化物歧化酶(SOD)是細胞內重要的清除和減少自由基的抗氧化酶，其活性反映了機體抗氧化損傷的能力［13］。Marx 等［14］發現，在人內皮細胞炎癥反應后，PPARs被激活，SOD基因的表達上調。試驗結果表明，經25 μmol/L H2O2刺激氧化后，加入0.1 μmol/L WY14643，與對照組及單獨加入H2O2組相比，WY14643 能顯著性提高胚胎的發育率，通過DCHFDA 測定胚胎內部H2O2水平時發現，WY14643 添加組H2O2的水平顯著性低于其他各組，也證實了WY14643 在胚胎發育過程中能夠減少H2O2含量。可能是因為WY14643 的加入有效提高了抗氧化酶如SOD、CAT的活性，間接降低了ROS 水平，促進了胚胎的發育。試驗還發現，在胚胎發育過程中，胚胎內部的H2O2含量在4-細胞早期達到最高，而囊胚時期有所降低，這和Nasr-Esfahani 等［15］發現的體外培養的小鼠胚胎在2-細胞晚期ROS 含量明顯增多，并且在5 h 后達到最高水平相一致。

過氧化物酶體是細胞內重要的生物氧化場所，包含大量的抗氧化酶類，如CAT、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)，因此它對胚胎的抗氧化起著至關重要的作用，而PPAR 與過氧化酶體增殖［16］及細胞中一些抗氧化基因表達有著相當密切的關系［9，17］。近年來WY14643 作為PPARα 特異性激動劑其抗氧化作用越來越受到關注。國外臨床研究還發現［18］，WY14643 能夠改善2 型糖尿病患者由脂代謝導致的氧化損傷。然而WY14643 在胚胎中的抗氧化信號轉導途徑以及各種抗氧化酶基因表達等分子機制還有待進一步研究。

0.1 μmol/L WY14643 能夠顯著提高體外胚胎發育率;小鼠4-細胞早期H2O2水平達到最高，囊胚時期顯著性降低，而0.1 μmol/L WY14643 處理后能顯著降低其活性氧水平，說明適當濃度的WY14643 能夠有效清除活性氧，提高胚胎的抗氧化能力，有利于附植前胚胎的體外發育。

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