應用ISSR 技術鑒定杭白菊對葉斑病的抗性

郭慶海， 李丹霞， 王康才， 薛友榮， 周雪松， 陳志祥

(1.江蘇省濱海縣植保植檢所，江蘇 濱海224500;2.南京農業大學園藝學院，江蘇 南京210095;3.江蘇省濱海縣農業科學研究所，江蘇 濱海224500;4.江蘇省射陽縣盛大藥材有限公司，江蘇 鹽城224300)

杭菊花是中國傳統的藥食兼用藥用植物，隨著人們生活水平提高，保健意識加強，其市場需求逐年增加，種植面積也隨之擴大，但在老產區調查發現，由于連作，菊花病害尤其是菊花葉斑病等病害成為限制農民增產增收的障礙［1］。病害的判斷診治主要靠常規手段，用分子手段進行病害的鑒定分類則較少，張欣［2］應用RAPD 技術區別芒果抗炭疽病品種，李海生［3］利用ISSR 分子標記技術進行了植物遺傳多樣性的分析應用，高山等以ITS1 和ITS4 為 引 物擴增病原菌的ITS 片段，對葉斑病進行分子鑒定［4］。張正光等進行ITS 序列分析確定了根腐病的病原菌［5］。ISSR 簡單序列重復區間(Inter-simple sequence repeat，ISSR )是一種基于微衛星(Simple sequence repeat，SSR)序列發展起來的、利用PCR 擴增進行檢測的、十分有效的分子標記技術，廣泛應用于植物遺傳關系及遺傳多樣性、品種鑒定、系統演化等方面研究。作為一種新型的分子標記，ISSR 標記結合了RAPD 和SSR 的優點，具有模版需要量少，多態性豐富，無需試劑盒，結果記錄方便，試驗成本低，操作簡單，實驗穩定性較高等優點，但目前未見利用ISSR 技術鑒別菊花抗葉斑病品種的相關報道。為此，本試驗采用ISSR 技術對20 個杭白菊材料(其中10 個材料為抗病材料)的抗病性育成品種的早期確定、抗病品種的鑒定及抗病機理等進行研究，以期為菊花抗葉斑病品種篩選、品種鑒定提供一種有效的輔助手段。

1 材料與方法

1.1 材料

20 種材料采自南京農業大學園藝學院實驗基地，均為江蘇省濱海縣植保植檢所菊花課題組前期選育，由南京農業大學中藥材系王康才教授鑒定。品種名、田間抗性見表1。試驗材料包括杭白菊的2個品系新白品系(新白)和紅心品系(其他19 個品種)，其中新×香、紅心11×香菊和紅心11×菊花腦3個材料為雜交材料。

1.2 方法

采用改良的CTAB 法提取菊花基因組DNA［6］，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量和濃度，稀釋至50 ng/μl。ISSR-PCR 反應體系總體積為20 μl，其中包括200.0 μmol/L dNTP、0.5 μmol/L primer、10×PCR buffer、50 ng DNA template、1.5 U DNA polymerase、無菌水。PCR 擴增反應在BIO-RAD 公司MJ Mini 48 孔梯度PCR 儀上進行。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，45 ～55 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，39 個循環;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴增后每管加入6×溴酚藍1 μl，混勻后取10 μl 擴增產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠中含有1% 的4S Green。電泳緩沖液為1×TAE，電壓5 V/cm。在上海培青科技有限公司生產的JS-380 型凝膠成像系統上觀測并照相。

表1 試驗材料及其田間抗性Table 1 Accessions used in the study and their field resistance

1.3 數據統計及分析

根據PCR 擴增產物的電泳結果，在凝膠的某個相同遷移位置上有DNA 條帶的記為1，無DNA 條帶的記為0，采用POPGENE32 軟件計算多態位點百分率(PPB)、平均有效等位基因數(Effective number of alleles，Ne)、Nei’s 基因多樣性指數(Nei’s gene diversity，He)和 Shannon 信 息 多 樣 性 指 數(Shannon’s information index，I);用DPS 分析軟件的非加權配對類平均法(UPGMA)進行聚類分析。

2 結果

2.1 DNA 提取、引物篩選及多態性分析

提取并純化材料DNA，瓊脂糖凝膠電泳確定DNA。

利用3 個表型差異大的材料對100 條ISSR 引物進行篩選，確定23 條帶型清晰、多態性較好的引物對20 個試驗材料進行多態性分析。淘汰擴增效果差、帶型模糊、對個別材料擴增不出條帶的引物，最終篩選出10 條引物用于20 份材料的遺傳分析。共擴增出168 條清晰可辨譜帶，其中多態性帶135條;平均多態位點百分率為80.36%，多態性較高。擴增條帶集中在200 ～2 000 bp(表2)。如表2 所示在綜合比較各引物擴增效果后發現165 號引物多態性條帶百分率達100.00%，故選取165 號引物作為最理想的引物。圖1 為ISSR 引物165 的擴增結果。

表2 有效ISSR 引物序列及其多態性Table 2 Efficient ISSR primer sequences and their polymorphisms

圖1 ISSR 引物165 對供試材料的PCR 擴增圖譜Fig.1 PCR amplified pattern of Dendranthema morifolium with ISSR 165

2.2 20 個菊花品種ISSR 遺產多樣性分析

平均有效等位基因數(Ne)和Nei’s 基因多樣性指數(Nei’s gene diversity，He)是衡量遺傳變異最常用的2 個遺傳指標，具有明顯的遺傳學意義［6］。Shannon 信息指數方便與同類研究進行比較［7］。利用軟件包POPGENE32 對各位點的Ne、He以及Shannon 信息指數進行計算，結果顯示，20 個品種平均有效等位基因數為1.549 1，平均Nei’s 基因多樣性 指 數 為0.312 9，平 均 Shannon 信 息 指 數為0.458 8。本研究擴增的ISSR 片段多態性較高，說明在進化過程中，菊花栽培品種在DNA 分子水平上形成并保持了較高的遺傳變異，還可能與菊花品種存在自交不親和性［8-9］及無性繁殖有關。

2.3 菊花對葉斑病抗性與其ISSR 聚類組的相關性分析

由圖2 可以看出，以遺傳距離為0.38 處劃分，20 個菊花品種聚類為3 個ISSR 組:第1 組包括大花2 號、大花4 號、優單4 號、優單6 號、紅心9 號、紅心13 號、紅心19 號、紅心1 號、紅心20 號、單瓣2號，這一組均是高感、中感品種;第2 組包括NJK1、NJK2、NJK3、似貢3 號、紅心11 號、新×香、紅心11×香、紅心11×腦、NJK4，具有抗葉斑病的品種都聚在這一類;第3 組只有一個品種，是新白。

圖2 20 個菊花品種ISSR 標記的UPGMA 聚類圖Fig.2 Dendrogram of 20 Dendranthema morifolium cultivars based on ISSR markers by UPGMA

對20 種菊花材料運用POPGENE 軟件進行分析，結果(表3)顯示，在20 種菊花材料中，H最大值為0.498 7，最小值為0.05;I最大值為0.693 1，最小值為0.119 3。這些結果顯示出試驗材料存在著豐富的遺傳變異，推測與菊花長期的自然雜交、自然選擇和人工選育造成的復雜的遺傳背景有關，這說明菊花具有極其豐富品種的分子基礎。在分成2 個類群的基礎上，比較抗性材料與感病材料可知:抗性材料的Ne、H及I值均高于感病材料，說明抗性材料之間比易感病材料之間基因差異顯著，抗性材料的遺傳多樣性比感病材料高。

表3 POPGENE 軟件分析結果Table 3 The results analyzed by POPGENE software

從ISSR 標記聚類結果來看，聚類結果與杭菊花對葉斑病的田間抗性有明顯的相關性，基本能夠區分抗性品種和易感品種。

3 討論

從ISSR 標記聚類結果來看，聚類結果與菊花對葉斑病的田間抗性有明顯的相關性。所有抗性材料除了新白全部聚為抗葉斑病品種，除此之外，3 個雜交品種也聚到這一大組中，這個結果也說明了雜交技術在培育抗病新品種中的優勢［10］，而所有易感病材料聚為高感、中感品種。新白是另一個品系的品種，在這里單獨聚為一類。

對易感和具有抗性的2 組試驗材料統計的結果顯示，抗性材料的平均有效等位基因數、平均Nei’s基因多樣性指數及Shannon 信息指數均高于感病材料，表明抗性材料的遺傳多樣性比感病材料高。可能是因為抗性的遺傳多樣性豐富，包括的抗病基因相對感病組較多，所以具有抗病性，其具體抗病基因位點仍需要繼續研究。本研究因時間和條件限制僅應用ISSR 技術對菊花抗葉斑病進行鑒定，是否可以應用ISSR 技術鑒定菊花甚至其他植物的其他病害仍需繼續研究。

ISSR 標記聚類結果表明，利用ISSR 技術可以鑒定菊花是否抗葉斑病，該技術可以作為早期篩選抗葉斑病品種的輔助手段。

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