SQR 基因在Nisin 抗性乳酸乳球菌中的表達

于建寧， 潘偉芹， 王公金， 徐小波， 李 燕， 于峰祥

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京210014;2.南京師范大學醫學分子生物學重點實驗室，江蘇 南京210097)

隨著畜牧產業的快速發展，養殖場規模的不斷擴大，畜禽糞便產生的廢氣(H2S、NH3等)已經成為不容忽視的空氣污染源，如何使這些廢氣無害化是保證環境友好型養殖業健康發展的必要條件之一。然而，目前只能采用吸附法、焚燒法或使用除臭劑等，這些方法一定程度上降低了廢氣對環境的污染，但還不能做到無害化。所以探求一種廢氣無害化處理方案很有必要。

硫化物-醌氧化還原酶［1］(SQR)是一種黃素蛋白質，存在于一些必須依靠硫化物作為氫供體生長的光合化能自養菌中，SQR在藍細菌、顫藻屬和光合細菌莢膜紅桿菌中已被深入研究，發現其具有分解硫化氫為厭氧光合細菌提供氫的特征［2-3］。乳酸菌是人和動物腸道中極為重要的益生菌，隨著乳酸菌的各種表達調控元件的成功分離，使得乳酸菌成為較理想的轉基因工程受體菌［4-10］。抗性基因NisⅠ作為篩選標記篩選乳酸乳球菌轉化子是最早研究的乳酸菌食品級抗性篩選標記系統。芬蘭赫爾辛基大學Takala 等［11］在2002 年構建了食品級克隆載體pLEB590，整個載體全部由乳酸乳球菌的片斷構成:pSH71 復制子、NisⅠ基因、組成型啟動子P45(控制NisⅠ的表達)，將此載體電轉化乳酸鏈球菌素(Nisin)敏感的乳酸乳球菌MGl614，以60 IU/ml 的nisin作為篩選濃度，1 μg DNA 可以得到105 個轉化子，且在nisin 的選擇壓力下，pLEB590 可以在乳酸乳球菌MGl614 穩定存在。同時食品級表達載體pLEB590 已經成功地電轉化入帶有多個隱蔽型質粒的發酵干酪工業菌株(Lactobacillus casei)，而且應用此載體已經成功地在植物乳桿菌中表達了來自瑞士乳桿菌(Lactobacillus brevis)的脯氨酸亞氨基肽酶基因(pepI)［11］。這些研究結果表明，載體pLEB590 可以應用于食品級表達系統來表達外源基因以應用于食品工業。

本研究擬構建攜帶SQR基因的重組表達載體，將其轉入乳酸菌，鑒定其表達SQR的功能，為下一步開展SQR轉基因乳酸菌微生態制劑的研制，以及有效解決畜禽養殖過程中H2S 等硫化物的排放問題提供關鍵技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌DH5a、乳酸乳球菌MG1363(Lactococcus LactisMG1363)、表達載體pMG36e 與質粒pcDNA3.1-SQR-Myc均由本實驗室保存。大腸桿菌DH5a 培養采用LB 培養基，37 ℃振蕩培養;乳酸菌MG1363 采用GM17 培養基，30 ℃靜止培養。紅霉素在大腸桿菌DH5a 和乳酸菌MG1363 培養中的濃度分別是250 μg/ml 和10 μg/ml。

T4 DNA 連接酶、DL5000 Marker、限制性內切酶、膠回收試劑盒及PCR 相關試劑均購自大連Takara 公司，電擊杯為Bio-Rad 產品。抗Myc 的小鼠一抗、辣根過氧化物酶偶聯的羊抗小鼠二抗購于天根公司。SDS-PAGE 所需生化試劑均購自上海生工公司。

1.2 重組質粒pLEB590-SQR 的構建

1.2.1SQR基因的擴增 提取質粒pcDNA3.1-

SQR:將本實驗室保存的pcDNA3.1-SQR菌種進行擴大培養，按照常規方法快速提取質粒備用。PCR 擴增SQR片段:上游引物序列P1 為5'-CGGGATC CAAGTAGAAGATGGCTCATATCG-3'， 下 劃 線 部 分為BamH I 酶切位點，下游引物P2 為5'-GCTCTAGAGGCACAGTCGAGGCTGAT-3'，下劃線部分為XbaI酶切位點，PCR 反應為50 μl 反應體系。

1.2.2 回收的SQR片段TA 克隆至T 載體 對PCR 擴增片段回收產物(SQR片段)進行3'端加A反應，72 ℃保溫10 min。在離心管中配制DNA 溶液(pMD18-T 1 μl，DNA 2 μl，溶液I 5 μl，雙蒸水2 μl)，16 ℃反應30 min。反應結束后將上述10 μl溶液全部加入至感受態細胞中，冰上放置10 min。42 ℃熱激45 s 后，再在冰上放置1 min。加入890 μl 培養基，37 ℃振蕩培養60 min。在含有X-Gal、IPTG、Amp 的瓊脂平板培養基上37 ℃培養過夜。

1.2.3 pMD18-T-SQR的鑒定 挑取單克隆菌株于3 ml 試管搖菌過夜，小量提取質粒進行XbaI 與BamH I 雙酶切鑒定，37 ℃作用1 h，反應結束后，取5 μl 反應產物在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察。

1.2.4 表達載體pLEB590 的大量提取 根據分子克隆實驗指南［12］，并參考質粒大量提取試劑盒(天根公司)說明書，進行操作，獲得的質粒保存于雙蒸水中。

1.2.5BamHI 和XbaI 酶切載體pLEB590 和回收的PCR 產物 pLEB590 酶切體系如下:pLEB590 5.0 μl，XbaI、BamH I 各1.0 μl，10 倍緩沖液1.5 μl，雙蒸水21.5 μl，共計30.0 μl。PCR 產物SQR酶切體系如下:SQR5.0 μl，XbaI、BamH I 各1.0 μl，10 倍緩沖液1.5 μl，雙蒸水21.5 μl，共計30.0 μl。

1.2.6 膠回收載體pLEB590 和目的片段SQR按照膠回收試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 載體pLEB590 與SQR連接 根據測定的回收載體pLEB590 和目的片段SQR的濃度，將載體與目的片段按一定比例連接，即pLEB590 10 μl，SQR5 μl，10 倍T4 DNA 連接酶緩沖液2 μl，T4 DNA 連接酶1 μl，雙蒸水2 μl，共計20 μl 反應體系。

1.2.8 連接產物純化 將數個連接反應管中的反應液合并至一個管內，加入3 倍體積的PCR-A 緩沖液;混勻后轉移到制備管中，12 000g離心1 min，棄濾液。將制備管置回2 ml 離心管，加700 μl 緩沖液W2，12 000g離心1 min，棄濾液;加400 μl 緩沖液W2，12 000g離心1 min。將制備管置于潔凈的1.5 ml 離心管中，在制備管中央加 25 ～30 μl 雙蒸水，室溫靜置1 min，12 000g離心1 min 洗脫DNA。

1.3 重組質粒pLEB590-SQR 在乳酸乳球菌中的表達

1.3.1 乳酸乳球菌的感受態制備 挑取乳酸乳球菌MG1363 單菌落，在3 ml GM17 培養基中培養過夜。將過夜培養物按5 %接種量加入到含1 %甘氨酸的SGM17 培養基中，30 ℃培育6 h(OD值約為0.8)。冰浴使細菌停止生長，4 ℃ 5 000g離心10 min，棄上清，用冰預冷的洗滌液洗3 次，以去除培養基中的離子成份。用冰冷的原體積5 %電擊緩沖液重懸菌體，放置10 min，每管100 μl 分裝。

1.3.2 乳酸菌的電擊轉化 取10 μl 純化連接產物與感受態MG1363 混合，冰浴10 min，電擊。電擊參數如下:電壓2 kV，電容25 μF，電阻400 Ω。30℃復蘇培養2 ～3 h 后，將其涂布在含有40 IU/ml Nisin 的GM17 平板上，培養1 ～2 d。

1.3.3 重組質粒鑒定 雙酶切鑒定:挑取單菌落進行液體擴培，利用質粒小提試劑盒進行質粒提取。隨后進行重組質粒XbaI 與BamH I 雙酶切，30 ℃作用30 min 后，37 ℃水浴作用1 h。反應結束后，取5 μl 反應產物于1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察鑒定。重組質粒PCR 鑒定:根據SQR序列設計引物P3 與P4，P3 為5'-GGTTTGGGCGGTGCCATCAT-3'，P4 為5'-CCCTTCTTCACGGCCTTCAGC-3'。PCR 反應體系為:Taq酶預混液12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，重組質粒1.0 μl，雙蒸水10.5 μl，共計25.0 μl。反應結束后取3 μl PCR 產物進行1 %瓊脂糖電泳。

1.3.4 重組質粒pLEB590-SQR-MG1363 質粒遺傳穩定性檢測

1.3.4.1 pLEB590-SQR-MG1363 生長遲滯期及世代時間的測定 取1 ml 菌液于100 ml GM17 培養基中混勻，分裝于10 ml 試管中，每個試管2 ml，30 ℃靜置培養。每1 h 取3 個試管測菌液OD600值，并將菌液稀釋一定倍數，接種于GM17 平板，30℃培養24 h，計算活菌數(CFU/ml)。以培養時間為橫坐標，所測菌液OD600值為縱坐標繪制pLEB590-SQR-MG1363 生長曲線圖。取對數生長期中的一段按以下公式計算世代時間，G=(t1-t0)ln2/(lnxlnx0)，式中G為世代時間，t1為培養時間，t0初始培養時間，x0為開始時的活菌數，x為經t時間培養后的活菌數。

1.3.4.2 pLEB590-SQR-MG1363 遺傳穩定性測定從不含nisin 的平板上選取100 個單菌落點種于含nisin 的平板上，最后長出的菌落數即為質粒穩定率。具體測定過程如下:從原代菌株平皿挑取單菌落于含40 IU/ml nisin GM17 的GM17 液體培養基中，培養過夜。第2 d 按1 %的接種量接種于含nisin 和不含nisin 的GM17 液體培養基中30 ℃靜置培養。每隔10 代(9 h)轉管，獲得不同代數的菌液。分別取10 ～150 代的菌液適量按一定倍數稀釋后，涂布于不含nisin 的GM17 平板，30 ℃培養24 h。分別挑取100 個單菌落點種于相應含nisin 的平板，30℃培養過夜，計算工程菌MG1363 在有、無nisin 選擇壓力傳代質粒的丟失率。

1.3.5 重組質粒pLEB590-SQR在乳酸乳球菌MG1363 中的表達 收集菌體，用雙蒸水洗2 次，加入終濃度10 mg/ml 溶菌酶100 μl，37 ℃消化30 min。加100 μl 2×上樣緩沖液，100 ℃反應5 min，高速離心后用于SDS-PAGE 電泳。Western blot 分析:SDSPAGE 電泳結束后，取出凝膠。將PVDF 膜在甲醇中浸濕15 s，在雙蒸水中浸泡2 min，然后轉移到濕轉液中。將在轉移緩沖液中浸泡的膠與PVDF 膜放入轉印夾中，接好轉印裝置并將其放入冰水中，300 mA，90 min。轉膜結束后，將PVDF 膜放于5%脫脂奶粉中封閉，室溫搖動2 h。一抗1 ∶1 000 稀釋過夜，TBST 洗滌10 min，共洗3 次;二抗1 ∶500 稀釋，室溫搖動2 h，TBST 洗滌10 min，共洗3 次，ECL 顯色。

2 結果

2.1 重組質粒pLEB590-SQR 的構建

以提取的質粒pcDNA3.1-SQR為模板，以引物P3、P4 進行PCR 反應，擴增得到大約1 400 bp 片段(圖1)，與預期片段長度相符。

將PCR 擴增到的SQR基因片段與pMD18-T-載體連接后轉化E.coliDH5α，在含有Amp、IPTG 和X-gal 的LB 平板上進行藍白篩選，含有插入目的片段的轉化子呈現白色菌落，只轉入空載體的大腸桿菌呈現藍色，隨機挑取幾個白色菌落接種到5 ml LB液體培養基(100 μg/ml Amp)，37 ℃培養過夜后提取質粒進行酶切鑒定。如圖2 所示，可見已經成功將SQR片段連接入pMD18-T 載體中。

圖1 PCR 擴增SQR 產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of SQR amplified by PCR

圖2 pMD18-T-SQR 質粒酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis of pMD18-T-SQR digested by enzymes

圖3 pLEB590-SQR 雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pLEB590-SQR digested with two enzymes

圖4 pLEB590-SQR PCR 擴增產物Fig.4 PCR amplification of PLEB590-SQR

2.2 重組質粒pLEB590-SQR 在乳酸乳球菌MG1363 中的鑒定與表達

挑取含有40 IU/ml nisin 的GM17 平板上菌落，提取質粒進行雙酶切鑒定。結果(圖3)顯示，重組質粒用BamH I 和XbaI 酶切后得到1 條 3 100 bp 的載體片段和1 個 1 400 bp 的目的片段。以pLEB590-SQR為模板擴增SQR內部片段，得到1 200 bp 片段(圖4)。

提取轉化前后乳酸乳球菌中的蛋白質，進行SDS-PAGE 電泳(圖5)，1 泳道為陰性對照，2、3 泳道為pLEB590-SQR-MG1363 陽性菌株，可見在分子量5.0×104下方有一特異條帶，與SQR基因表達產物分子量一致，約 4.8×104。提取乳酸菌表達的蛋白質進行Western blot 雜交試驗(圖6)，1 泳道為MG1363 陰性，無特異條帶，2、3泳道為陽性pMG36e-SQR-MG1363，在分子量5.0×104下方有特異條帶，表明乳酸菌中表達了目的蛋白質SQR(約4.8×104)。

圖5 pLEB590-SQR 表達蛋白質的SDS-PAGE 電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of pLEB590-SQR expressed proteins

圖6 Western blot 檢測MG1363 中SQR 的表達Fig.6 SQR expression in MG1363 detected by Western blot

2.3 乳酸菌遺傳穩定性分析

以培養時間為橫坐標、菌數的OD600值為縱坐標繪制pLEB590-SQR-MG1363 的生長曲線(圖7)，從該曲線可以看出pLEB590-SQR-MG1363 的生長延滯期為2 h。再從曲線的對數生長期段上任取2個時間，本次取對數期的3 h、5 h 菌液按 10-7～10-8稀釋菌液涂板，得出3 h 菌落數為 6×108CFU/ml，5 h 菌落數為4.2×109CFU/ml。根據公式G=(t1-t0)ln2/(lnx-lnx0)計算世代時間G=43 min。由以上結果可得出pLEB590-SQR-MG1363 從開始培養到傳代10 次所需要的時間為:10G+t1=9 h。

圖7 乳酸菌pLEB590-SQR-MG1363 生長曲線圖Fig.7 The growth curve of pLEB590-SQR-MG1363

將pLEB590-SQR質粒的乳酸乳球菌MG1363連續培養150 代，在有、無nisin 選擇壓力下質粒穩定率都在91 %以上(圖8)。結果表明，pLEB590-SQR在乳酸乳球菌MG1363 中具有較好的遺傳穩定性，并且穩定性不受nisin 影響。

圖8 pLEB590-SQR-MG1363 在有、無選擇壓力下的遺傳穩定率Fig.8 Genetic stability of pLEB590-SQR in MG1363 with and without nisin

3 討論

近十余年來，國內外科學家對SQR基因的序列結構及其降解硫化物的生物功能進行了系統的研究，取得顯著進展。Shütz 等［2］從紅莢膜桿菌中分離純化出SQR，并將SQR基因成功克隆于大腸桿菌，表達出具有生物酶活性的SQR。Bronstein 等［13］也得到相似的研究結果。本試驗也將SQR成功導入大腸桿菌中并獲得表達。但由于大腸桿菌還含有一些毒蛋白質且容易形成包涵體，表達產物需要一系列純化復性過程，再加上大腸桿菌為非食用菌，不利于后期制作微生態制劑用于動物實驗。為此，我們利用乳酸菌能夠表達外源蛋白質的特點，在乳酸乳球菌中表達SQR 蛋白質。在我們的前期研究中，已經成功構建了SQR重組載體pMG36e-SQR［14］，并由此獲得了表達SQR的乳酸乳球菌MG1363，但需要紅霉素進行陽性篩選，對環境易造成二次污染，因此在本試驗中構建攜帶食品級抗性篩選標記的Nisin質粒pLEB590，從SQR質粒構建到表達SQR乳酸菌的篩選及SQR在乳酸菌中的穩定性幾個方面研究獲得食品級SQR 乳酸菌。

根據SDS-PAGE 電泳圖可以看出在5.0×104處有目的蛋白質，Western blot 雜交檢測也證實了SQR在乳酸乳球菌MG1363 中的表達。Takala 等［11］用pLEB590 在乳酸乳球菌和植物乳桿菌中表達了來源于瑞士乳桿菌中的pep I基因，其表達的目的蛋白質濃度是原菌株的200 倍。羅立新等［15］將小鼠的mCu/ZnSOD基因與 pLEB590 重組，在宿主菌MG1464 中進行表達，結果該基因可以在宿主菌中進行活性表達，但是表達量較低。pLEB590 載體中目的蛋白質與食品級載體啟動子相距較遠，其表達量與RBS 位點堿基種類、數量以及與起始密碼子AUG 之間的距離都有很大關系。本試驗SQR表達量介于兩者之間。蛋白質的差異表達可能與基因以及所用的宿主乳酸菌種類亦有一定的關系。

本試驗結果表明，我們已經成功獲得了遺傳穩定性好的攜帶SQR質粒的食品級乳酸乳球菌。汪川等［16］研究結果表明，質粒pMG36e 在有、無紅霉素壓力下在乳酸乳球菌MG1363 中均能保持質粒的穩定性。范碩等［17］將質粒pLEB590 電轉入植物乳桿菌Lact2 中，在300 U/ml nisin 的MRS 培養基中連續轉接30 代，提取質粒進行鑒定，結果仍含有質粒，說明在有nisin 選擇壓力下，菌株能夠保持外源質粒的遺傳穩定性;而含有pLEB590 的植物乳桿菌Lact2 在無nisin 的液體MRS 培養基中，連續培養3代質粒丟失，說明在沒有nisin 的壓力下，質粒pLEB590 很容易丟失。本試驗檢測重組乳酸菌pLEB590-SQR-MG1363 的遺傳穩定性，在40 U/ml nisin GM17 培養基中傳代150 次，穩定性在96%以上，在無nisin 的選擇壓力下質粒保持其遺傳穩定性91%，說明乳酸乳球菌MG1363 能夠保持質粒遺傳穩定性。如何提高SQR在乳酸乳球菌中的表達量將是以后的研究重點，雖然SQR已經成功表達，但是否具有生物酶活性，能否有效降解畜禽糞便中的硫化物還有待進一步研究。

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