人工合成禽流感M2e/HA0 多肽的免疫原性分析

陸吉虎， 唐應華，3， 田 震， 劉振興， 查國飛， 陳 輝， 侯繼波

(1.江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京210014;2.南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京211102;3.南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京210095;4.安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥230036)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科、甲型流感病毒屬的A 型流感病毒引起的一種禽類感染和/或者疾病綜合征［1］。該病主要侵害禽類的呼吸系統、消化系統及神經系統等，產生從無癥狀或溫和癥狀到高致病性的感染。其中高致病性禽流感(Highly pathogenetic avian influenza，HPAI)表現為高發病率和高死亡率的全身感染，HPAI 的每一次流行，都會引起禽的大量死亡和生產性能的急劇下降，造成極大的經濟損失。目前使用的禽流感疫苗，主要是以病毒的膜蛋白質血凝素(HA)或者神經氨酸酶(NA)為關鍵靶抗原，完全或者主要依靠HA(或NA)誘導產生中和抗體。但是禽流感病毒基因中，HA 和NA 基因突變率很高［2-3］，從而導致抗原及致病力的易變異性，針對某一進化分支病毒抗原發展的疫苗對不同進化分支的病毒株缺乏有效的中和活性［4］，這加大了禽流感的檢測和防治難度。M2蛋白質是禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)中高度保守的蛋白質，在AIV 各亞型的不同毒株之間都具有很高的同源性［5-7］，主要以四聚體形式存在于流感病毒粒子表面，能誘導產生保護性免疫應答并且具有一定的交叉保護力［8］，因此是研究交叉保護性疫苗的理想抗原。而且，M2 的主要保護性抗原決定簇在M2 的膜外部分，即M2 氨基酸N 端的1 ～24個氨基酸(M2e)［6，9］，M2e 同樣可以誘導保護性免疫應答［10-11］。本試驗參照流感病毒M2 及HA 的氨基酸序列分別設計2 條多肽后進行人工合成并制成油乳劑疫苗進行動物免疫，以期為開發具有交叉保護性的禽流感疫苗打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 鏈霉親和素(Streptavidin，SA)為AMRESCO 公司產品;HRP 標記羊抗雞IgG 及FITC 標記羊抗雞IgG 購自Thermo 公司;DMEM 購自GIBCO

公司，96 孔細胞板、ELISA 板均為Costar 公司的產品;禽流感病毒H5(H9)亞型血凝抑制試驗抗原(Re-4/Re-6 株)購自哈爾濱維科生物技術開發公司。小牛血清購自杭州四季青生物工程公司;Tween-20、白油、司本-80 等試劑均為國產分析純試劑;PBS 緩沖液，本實驗室配制。

1.1.2 合成肽 根據文獻報道，參照流感病毒M2及HA 的氨基酸序列設計2 條多肽，由吉爾生化(上海)有限公司合成。M2e 序列為SLLTEVETHTRN，HA0 序 列 為 ACGLRNSPQRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVCA。同時合成M2e-biotin、HA0-biotin 多肽。

1.1.3 毒株、細胞及SPF 雞胚 禽流感H9N2 病毒SD01 株(A/Chinken/ShanDong/01/2011)由本實驗室分離鑒定為禽流感H9N2 病毒;MDCK 細胞由本實驗室凍存。SPF 雞(雞胚)系用購自北京梅里亞維實驗動物技術有限公司的SPF 種蛋，由本實驗室孵化，出殼后飼養于隔離器備用。重組禽流感病毒滅活疫苗(H5N1 亞型，Re-6 株)為哈爾濱維科生物技術公司產品;禽流感(H9 亞型，NJ02 株)滅活疫苗為南京天邦生物科技有限公司有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 多肽疫苗的制備及動物免疫 合成的M2e、HA0 多肽用PBS 溶解后加入4%吐溫-80，然后與白油(含4%司本-80)按照1 ∶3 體積比混合并充分乳化配制成油乳劑疫苗，每羽份(0.3 ml)抗原含量為300 μg。100 只SPF 雞隨機分成5 組，每組20 只，母源抗體血凝抑制(HI)效價降低至2lg2 以下后，采用頸部皮下注射法免疫(對照組用PBS 同法免疫)。隔2 周加強免疫1 次，共免疫3 次。第1 次免疫后每2 周翅靜脈采血(即分別為一免后的第2、4、6、8周采血)并分離血清用于檢測抗體效價。試驗分組及免疫情況見表1。

表1 試驗SPF 雞分組及免疫劑量Table 1 The grouping of SPF chickens and immune doses

1.2.2 免疫血清抗體的檢測 用微量血凝抑制試驗檢測血清抗體的HI 效價。ELISA 檢測免疫血清抗體的方法簡述如下:先用6 μg/ml 鏈霉親和素每孔200 μl 包被ELISA 板，于35 ℃濕盒孵育過夜;再加200 μl 2 μmol/ml 合成抗原Biotin-多肽，37 ℃濕盒孵育1 h，用1%BSA 的PBST(含5%吐溫-20 的PBS 溶液)溶液37 ℃封閉;待檢血清用含0.5%BSA 的PBST 稀釋600 倍，分別加入相應孔內，37 ℃孵育1 h;每孔加入100 μl 1 ∶20 000 的HRP 標記的羊抗雞IgG，37 ℃濕盒反應1 h 后，加入現配制的TMB 底物溶液每孔100 μl，37 ℃顯色10 min。每孔加入100 μl 2 mol/L H2SO4終止反應，讀取吸光值OD450。比較兩種合成肽疫苗免疫后產生的抗體水平。

1.2.3 免疫后血清的病毒中和抗體效價 用固定病毒稀釋血清法，將免疫后血清56 ℃滅活30 min后，用含5 μg/ml TPCK(甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮)胰酶的DMEM 培養液進行2 倍倍比稀釋，每個稀釋度分別與2 000TCID50/ml 禽流感H9 亞型SD01 病毒液等體積混合［12］，置37 ℃反應1 h 后，按每孔100 μl 接種至鋪成單層MDCK 細胞的96 孔細胞板內。每一個稀釋度接種4 個重復孔。同時設病毒對照(200TCID50)、商品滅活疫苗免疫血清及商品滅活疫苗免疫血清與病毒混合液對照。置37 ℃的5% CO2培養箱培養120 h，記錄出現CPE(致細胞病變效應)孔數，結果以3/4 以上細胞孔未發生病變的最高稀釋度記為有效中和保護效價。

1.2.4 間接免疫熒光檢測免疫后血清 用含10%

犢牛血清的DMEM 培養液在37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養MDCK 細胞24 h，棄去上清，加入200TCID50的禽流感H9N2 亞型病毒SD01 株，置于37℃、5% CO2細胞培養箱內孵育20 h。棄掉培養液，用PBS (pH 7.4)洗滌3 次，加-20 ℃預冷的丙酮∶乙醇(6 ∶4)，固定5 min，再用PBS 漂洗3 次后干燥。分別加入用PBS 稀釋50 倍的檢測血清和陰性對照血清，于37 ℃孵育1 h。用PBS 沖洗3 次，加入FITC 標記羊抗雞IgG，避光37 ℃反應30 min。用PBS 洗滌3 次并風干后用熒光顯微鏡觀察，驗證產生的抗M2e/HA0 抗體能否與表達在感染MDCK 細胞表面的M2/HA 結合。

1.2.5 免疫雞攻毒后的排毒檢測 試驗雞第3 次加強免疫后第4 周，對免疫組和對照組均用禽流感病毒H9N2 亞型SD01 株進行滴鼻接種病毒，每只雞接種病毒108EID50/ml。攻毒后雞飼養于隔離器中，觀察14 d，記錄試驗雞死亡及發病情況，同時于攻毒后3 d、5 d、7 d 分別采集喉拭子和肛門拭子。將同一只雞的喉拭子和肛門拭子混合，8 000 r/min離心5 min 后取上清，以每只0.1 ml 接種10 日齡SPF 雞胚5 只，36 ℃繼續孵化，去除24 h 內死亡的雞胚，在120 h 后將所有健活雞胚于4 ℃全部凍死，然后檢測各胚的HA 效價。雞胚尿囊液的血凝價(HA)≥22判為陽性。

2 結果

2.1 免疫血清抗體滴度

M2e/HA0 多肽苗和H5/H9 亞型滅活苗免疫后血清分別用禽流感病毒H5 亞型和H9 亞型血凝抑制檢測抗原檢測，結果顯示M2e/HA0 多肽苗組血清均未檢測到HI 抗體，而H5 亞型和H9 亞型滅活苗組免疫后第2 周血清的HI 抗體效價分別為6.49 lg2 和7.06 lg2，第8 周血清的HI 抗體效價分別達9.15 lg2 和9.78 lg2(表2)。

表2 疫苗免疫后血清的HI 效價Table 2 HI titers of serum antibody following immunization

以血清1 ∶600 稀釋的OD450值作為抗體滴度，分別以合成的M2e-biotin、HA0-biotin 多肽進行包被檢測含M2e、HA0 多肽疫苗免疫后血清的抗體效價。以M2e-biotin 包被檢測M2e 多肽及H5 和H9滅活苗免疫組一免后第8 周血清ELISA 抗體效價，分別為0.783、0.223 和0.234(圖1A);以HA0-biotin 包被檢測HA0 多肽及H5 和H9 滅活苗一免疫后第8 周血清的抗體效價，分別為0.767、0.470 和0.365(圖1B)。M2e 和HA0 多肽疫苗免疫后血清的ELISA 抗體效價明顯呈上升趨勢，且都比H9 和H5 滅活苗免疫后血清的效價高(圖1)。

圖1 SPF 雞免疫M2e/HA0 多肽苗后血清ELISA 抗體水平Fig.1 ELISA titers of serum antibody in SPF chicken following vaccination with peptide M2e/HA0

2.2 血清的病毒中和抗體效價

免疫后血清的病毒中和抗體效價判定標準為以3/4 細胞孔未出現病變的最高血清稀釋度作為有效中和效價。禽流感H9 滅活苗首免后第4、6、8 周的血清中和效價最高，分別為1 ∶128、1 ∶256 和1 ∶128。兩種多肽疫苗免疫血清效價在首免后第8 周HA0 組比M2e 組高(分別為1 ∶16 和1 ∶8)，第6周均為1 ∶16。禽流感H5 滅活苗的免疫血清效價遠低于H9 滅活苗免疫血清的中和效價，也低于M2e/HA0 多肽苗的免疫血清中和效價(表3)。

表3 免疫后血清與SD01 株的中和試驗結果Table 3 Neutralization test results of immunized chicken serum with strain SD01

2.3 血清抗體間接免疫熒光

如圖2 所示，用禽流感H9N2 亞型病毒SD01株感染MDCK 細胞與免疫后的血清孵育后再結合FITC 標記抗體，觀察抗原抗體結合特性，熒光顯微鏡(×10)下觀察。H9 和H5 滅活苗組血清均能在MDCK 的胞內產生明亮的熒光顆粒，且H9 滅活苗組含熒光顆粒的MDCK 細胞約達到70%左右(圖2A)，H5 滅活苗組血清含熒光顆粒的MDCK 細胞約50% 左右(圖2B)。多肽苗(M2e/HA0)組含熒光顆粒的MDCK 細胞僅約20%左右，且熒光亮度較弱(圖2C、圖2D)。陰性血清對照組的細胞表面沒有熒光(圖2E)。表明免疫血清能夠與病毒表達在感染細胞表面的M2 和HA 結合。

2.4 免疫雞攻毒后排毒檢測

對免疫后試驗雞進行攻毒試驗，結果見表4。M2e 疫苗組與HA0 疫苗組攻毒后第3 d 分別有9 和10 只雞出現排毒情況，第7 d 都有所下降，分別為5只和8 只。H9 亞型滅活苗組攻毒后3 d 出現排毒雞數量與M2e 疫苗組相當，但是7 d 后H9 亞型滅活苗組已經無排毒雞。

圖2 間接免疫熒光檢測感染H9 禽流感的MDCK 細胞與血清反應性Fig.2 Fluorescence microscopic observation of the reaction between sera and MDCK cells infected with H9 AIV

表4 禽流感病毒H9N2 亞型SD01 株攻毒后各組雞的排毒情況Table 4 Virus shedding of chicken groups post challenge with H9N2 subtype AIV strain SD01

3 討論

AIV 亞型眾多，變異快，給檢測和防治工作都帶來了困難。長期以來，人們期望能夠發展通用型禽流感疫苗來達到一勞永逸的免疫預防效果。禽流感的外膜蛋白質包括HA、NA、M2 三類，其中的HA、NA基因突變率最高，而M2 是高度保守的抗原分子，是發展通用型疫苗的理想靶抗原［13］。M2e 蛋白質可誘導產生交叉保護抗體［10-11］，Ernst 等［11］用合成的M2e 抗原多肽與佐劑混合后經鼻腔免疫小鼠，攻毒能產生明顯的免疫保護;桿狀病毒表達的M2蛋白質也能夠誘導產生免疫保護并具有交叉保護力［14］。尚書文等［15］將M2基因與雞IgG Fc 片段基因相串聯，在巴斯德畢赤酵母中融合表達，免疫試驗證明融合蛋白質可以誘導產生較高水平的抗M2e蛋白質抗體。本試驗在對不同亞型禽流感的M2 和HA 氨基酸序列分析比對的基礎上，選擇了部分保守肽段并適當優化后合成小分子肽段，然后制備成油乳劑疫苗免疫SPF 雞，同時與市售禽流感H5/H9滅活疫苗進行對比試驗。以合成M2e-biotin(HA0-biotin)多肽包被ELISA 板分別檢測對應多肽疫苗免疫后的血清抗體效價，結果都比H5 和H9 滅活苗免疫的血清效價高，證明了合成的M2e 和HA0 多肽具有較好的免疫原性，可以誘導產生較高水平的抗體。用禽流感H9 亞型SD01 株病毒對免疫后血清測定中和抗體效價，多肽免疫組最高效價為1 ∶16，遠低于H9 血清中和效價(1 ∶256)，但是都比H5 滅活苗的免疫血清效價高(1 ∶4)，表明合成多肽疫苗具有一定的交叉保護性。在隨后的攻毒排毒檢測試驗結果表明，兩個多肽疫苗免疫組都能夠有效地抑制試驗雞攻毒后排毒，其中M2e 免疫組抑制效果略好于HA0 免疫組。多肽抗原是完整病毒的一部分，不具有傳染性并且可以大量生產，是發展疫苗的途徑之一。早在上個世紀，Lerener 等［16］就提出了開發合成肽疫苗的觀點，即先確定天然抗原的氨基酸序列

及抗原決定簇肽段，然后合成抗原肽并驗證合成肽免疫原性，篩選出具有保護性的抗原肽來制備疫苗。本試驗進一步證實了M2e/HA0 多肽具有較好的免疫原性，可以誘導產生保護性抗體，為開發通用型禽流感亞單位疫苗奠定了基礎。

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