利用微衛星標記對綿羊進行親子鑒定

劉龍騰， 賈春旸， 努爾力·阿不力孜， 張文祥， 趙宗勝

(石河子大學動物科技學院，新疆 石河子832003)

在現代動物育種中，由于要利用各種親屬的表型信息，準確的系譜記錄十分重要，然而在有些情況下，不能準確地確認某些個體的父本，不能準確地判斷個體的親緣關系，從而影響綿羊育種工作的順利開展。因此對家畜特別是種公畜的系譜確證就顯得更為重要。

用微衛星DNA 進行親子鑒定是一新興的生物技術，在國內外多種家畜和動物上做過試驗并取得較好的結果。Glowatek-Mullis 等［1］用分屬不同染色體的多態微衛星位點成功解決了以前用血型無法解決的35 頭牛的血緣控制問題。Fredholm 等［2］用6 ～9 個分屬不同染色體的多態微衛星位點鑒定了來源于12 個品種狗的血緣，此外還利用微衛星位點對一個有爭議的母本進行了確認(概率99.99%)。Hygen 等［3］對用微衛星位點進行血緣鑒定進行了評估，使用分屬7 條染色體的22 條微衛星在牛群中分2 種情況計算排除概率，在被懷疑個體基因型未知時排除概率大于 0.998 6，被懷疑者基因型已知時排除概率大于0.999 9。Luikart 等［4］用分屬16 條染色體上22 個微衛星位點對山羊進行親子鑒定，結果表明在開士米山羊、安哥拉山羊和薩能山羊中排除概率分別為:大于0.999 999、大于0.999 99、大于0.999 9，同時證明兩個個體完全相同的概率為1×10-15。

本試驗采用微衛星DNA 分子標記的方法，利用

BM4621、BM143、OarHH55、OarJMP8、BM6438、BM6506、BM1824、OarDB6、ILSTS004 9 個微衛星位點，對132 只中國美利奴羊中的7 組親子進行親子鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗血樣制備及基因組DNA 的提取［5］

血液樣本取自新疆紫泥泉種羊場的132 只中國美利奴羊(新疆軍墾型)，其中包括7 個不同的親子關系清楚的個體及其父母本。祖代及后代羊都飼養于該場，飼養管理穩定，無疾病史。綿羊頸靜脈采血約6 ml，參照劉云芳等［6］的方法提取綿羊基因組DNA。

1.2 微衛星位點引物合成及PCR 擴增

選取的9 個微衛星引物均由上海生物工程公司合成，其堿基序列及退火溫度見表1。PCR 擴增反應體系:10×Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl，上下游引物各3.0 μl (5 pmol/μl)，TaqE(0.5 U/μl)4.0 μl，模板DNA (50 ng)2.0 μl，總體積25.0 μl。PCR 擴增條件為:95℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，在適宜的溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環，最后72 ℃延伸10 min。

1.3 擴增產物的電泳檢測

25 μl PCR 產物中加 3 ～5 μl 溴酚藍指示劑，混勻后加10 μl 在聚丙烯酰胺凝膠(濃度為10%)中電泳，穩壓150 ～180 V，電泳 6 ～8 h。電泳結束后進行固定、染色、顯影過程，凝膠成像系統拍照。

采用銀染的方法，染色及顯影的過程如下:將凝膠放入固定液中預處理10 min，然后將凝膠放入染色液中染色25 min，取出后用蒸餾水漂洗15 ～20 s，置于顯影液中，約 8 ～10 min 出現條帶后，取出凝膠用自來水快速漂洗2 次，放入固定液終止10 min，觀察結果并拍照［7］。

表1 9 個微衛星標記的引物序列及退火溫度Table 1 Primer sequences of nine microsatellite markers and reference annealing temperatures

1.4 數據處理及統計方法

1.4.1 基因頻率及基因型頻率 基因頻率是指群體內某一基因座上特定等位基因占該基因座等位基因總數的比率(Pi)，即為等位基因頻率，是群體遺傳特征的基本要素。Pi=［2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)］/2N，其中，Pi為某一位點上第i個等位基因的頻率，i為該位點上的第i個等位基因，j1、j2、…、jn為與i共顯性的第1 到第n個等位基因;N為該位點上的等位基因數。基因型頻率是指一個群體內某特定基因型所占的比例，它是描述群體遺傳結構的重要參數。由于微衛星擴增結果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率，基因型頻率=基因型個體數/測定群體總數。

1.4.2 Handy-Weinberg 平衡的χ2適合性試驗Handy-Weinberg 平衡狀態的檢驗采用χ2適合性檢驗進行。首先根據基因頻率計算各種基因型頻率的理論值，然后計算χ2值。χ2=∑(E-O)2/E，E為理論值，O為實際觀察值。

1.4.3 父權概率計算［8-9］根據所檢測的表型，分別列出母本、子一代及假設父本的各種可能的基因型。根據母子組合，確定來自母本的基因(母本基因)和必定來自子一代父本的基因(父本基因)。計算嫌疑父本成為子一代父本的概率:X=f×c，式中f為母本提供母本基因的概率(當只有一種母本基因時，該基因100%遺傳給子代，故此時母本基因概率為1)，c為嫌疑父本提供父本基因的概率。計算種群中隨機個體成為子一代父本的概率:Y=f×g，式中f為母本提供母本基因的概率，g為種群中該父本的基因頻率。計算父權指數(PI)，PI=X/Y。再計算父權的相對機會RCP(Relative Chance of Paternity)值和累積RCP，RCP=PI/(PI+1)，累積RCP=1-(1-RCP1)(1-RCP2)……(1-RCPn)。

2 結果與分析

2.1 等位基因頻率分布

由表2 可知，9 個微衛星位點共檢測到56 個等位基因，平均每個位點6.2 個。OarHH55 位點等位基因最多，共檢測到8 個;BM6506、BM6438、BM1824 3 個位點都只檢測到5 個等位基因。

表2 綿羊9 個微衛星位點基因頻率分布Table 2 Allele frequencies of 9 STR loci in sheep

2.2 9 個STR 基因位點的基因分型

從表3 可以看出:在對7 組父母本與子代的親子鑒定中，第1 組的累積RCP值為0.999 8，第2 組的累積RCP值為0.999 9，第3 組的累積RCP值為0.999 9，第4 組的累積RCP值為 0.999 8，第5組的累積RCP值為0.999 9，第6 組的累積RCP值為0.999 9，第7 組的累積RCP值為0.999 9。這7組累積父權概率都已達到很高的鑒別水平，說明本試驗所用的9 個微衛星位點都可用做鑒定綿羊親子關系的微衛星標記位點。

表3 9 個微衛星位點PI 值及RCP 值Table 3 PI and RCP values of 9 STR loci

3 討論

親子鑒定又稱親權鑒定，SSR 分子標記技術［10-11］是目前國內外進行親子鑒定的新技術之一。賈名威等［12］在奶牛和肉牛中分別擇選了6 個微衛星座位，累積個體鑒別力和累積非父排除能力都很高。Ellegren 等［10］組合5 個微衛星位點(每個位點至少有6 個等位基因)排除率達98%以上，使用10個微衛星位點可使排除率達99.99%。賈斌等［13］利用10 個微衛星座位對新疆8 個綿羊品種進行遺傳多樣性分析，結果表明8 個高度多態性的座位可用于遺傳多樣性分析。Araujo 等［14］用11 個微衛星標記對巴西山羊進行親權鑒定研究，結果表明，當已知一方親本時的累計父權排除率為 0.999 59。張志和等［15］在大熊貓的親子鑒定中，父權排除率達到了0.999 921。李潔等［16］擇選13 個微衛星標記對甘肅高山細毛羊進行親子鑒定，累計父權排除概率為0.999 94，11 個高度多態的座位使累計父權排除率達到0.999 85。周磊等［17］利用微衛星技術研究親子鑒定，證明了微衛星座位的多態性決定了父權排除率的大小。錢林東等［18］使用微衛星標記分析發現，一般檢測的遺傳座位多少與鑒定概率成正比，相同的微衛星位點在群體中的等位基因數與正確鑒定結果的概率也成正比。本研究采用微衛星DNA 分子標記技術分析計算了132 只中國美利奴羊在9 個微衛星位點的等位基因頻率及其分布規律，9 個微衛星位點均表現為高度或中度多態性;對其中7 組父系半同胞親子進行了親子鑒定，獲得了0.999 8 ～0.999 9 的父權概率，說明這9 個微衛星位點在親緣關系較近的群體中做親子鑒定是可行的，這為綿羊親子鑒定試劑盒的研制奠定了基礎。

用微衛星DNA 或DNA 測序進行親子鑒定技術精確度較高，發展較快，但由于成本問題在家畜中較難開展和推廣。隨著分子生物學的發展和測序成本的降低，基于分子生物學的親子鑒定技術必將在家畜中得到廣泛的應用。所以篩選用于親子鑒定的可靠、合適的微衛星位點代替血型、DNA 指紋等傳統方法進行血緣鑒定和血緣控制在家畜中的應用潛力很大。

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