放線菌JXJ-0110 對銅綠微囊藻的溶藻活性

張 方， 李漢全， 楊建遠， 張炳火

(1.九江市環境保護監測站，江西 九江332000;2.九江學院生命科學學院，江西 九江332000)

藍藻水華已經成為世界性的嚴重環境問題［1-2］，中國尤為突出［3-4］。由于環境污染和全球氣候變暖等因素，水華暴發更為頻繁［5］，危害也越來越嚴重。目前藍藻水華防治方法主要有化學藥品(如Cu-SO4)殺滅法、物理方法(如黃土和黏土顆粒吸附除藻、機械除藻和超聲波除藻等)、以浮游動物和鰱鳙等魚類為主的生物操縱法以及用病毒、細菌等微生物控藻的方法等［6-10］。

硫酸銅等化學藥品控制水華雖然快速高效［11］，但會導致水環境二次污染［12-13］;黃土和黏土顆粒等吸附效果好，但會導致底棲生物二次影響［14］，且大面積應用尚有許多困難［15］;而超聲波等其他物理方法處理能力有限，只能作為輔助手段［16］;生物操縱必須在一定營養濃度、水體規模等條件下才能取得良好效果，且效果不是特別穩定［17］，而且有研究者認為，養魚加速了水體的富營養化，因為魚類的攝食與排泄造成了營養短路代謝，特別是加速了磷的活化過程［18］，因此生物操縱法難以解決大面積水華問題。

以微生物為主的生物防治法因其環境友好，近年來受到了越來越廣泛的關注［19-22］，是目前藍藻水華防治研究的熱點之一。產生天然活性產物殺藻是微生物殺藻的重要機制之一。天然產物具有高效、環境友好、選擇性強和容易降解等優點，是潛在的優良殺藻劑。放線菌是一類主要呈絲狀生長的原核生物，其代謝產物極其豐富，目前發現的具有生理活性的微生物次級代謝產物約有45%來源于放線菌［23］，即使是被廣泛研究的鏈霉菌也有97%的代謝產物未被人們發現［24］。因此，從放線菌中篩選高效環保的藍藻水華防治劑是值得深入研究的領域。本試驗擬初步研究一株溶藻放線菌及其代謝產物的溶藻效率、溶藻活性成分的部分性質及溶藻菌株的分類地位等，旨在為該菌在藍藻水華防治上的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種與放線菌來源

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosaFACHB-905)，中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。供試放線菌JXJ-0110，是九江學院生命科學學院微生物實驗室從廬山土樣中分離獲得。

1.2 銅綠微囊藻的培養

(1)液體培養，以HGZ 為銅綠微囊藻培養基，溫度為27 ℃，光照度為3 000 lx，光暗比為12 h ∶12 h，靜置培養，每天搖動4 次，每次30 s。(2)銅綠微囊藻半固體平板培養，按照文獻［25］的方法進行。

HGZ 培養基配方:NaNO3496 mg，KH2PO439 mg，MgSO4· 7H2O 75 mg，CaCl2· 2H2O 36 mg，Na2SiO3·9H2O 58 mg，土壤浸出液3 ml，PIV 金屬溶液3 ml (Na2-EDTA 75 mg，FeCl3·6H2O 9.7 mg，MnCl2·4H2O 4.1 mg，ZnCl20.5 mg，CoCl2·6H2O 0.2 mg，Na2MoO4· 2H2O 0.4 mg，蒸餾水100 ml)，蒸餾水994 ml，pH 8.0 ～8.5。

1.3 溶藻放線菌的篩選

初篩采用平板溶藻試驗。將前期工作獲得純培養的放線菌菌種采用點接種方法，分別接種于YIM38 固體培養基上，28 ℃下培養3 ～5 d，無菌條件下用打孔器將各單菌落打下，并放置于藻平板上，培養3 d 后觀察溶藻圈的產生情況。用同樣大小的YIM38 培養基瓊脂塊作空白對照。

復篩采用液體溶藻試驗。將初篩試驗中活性較好的菌株進行液體發酵，6 d 后終止發酵，并取2%(體積比)的發酵上清液加入藻液(藻細胞濃度為1 ml 1.0×107個)，培養3 d 后采用熱乙醇法［26］測定葉綠素a 的含量，根據葉綠素a 含量判斷溶藻效果。對照組藻液中加入2%(體積比)的無菌水。

發酵培養基配方:大豆粉15 g，葡萄糖15 g，酵母膏2 g，淀粉10 g，蛋白胨2 g，麥芽膏粉2 g，NaCl 4 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，定 容 至1 000 ml，pH 7.8 (定 容 測 pH 后，再將CaCO3加入培養基內)。

1.4 放線菌孢子和菌絲體的溶藻活性

取放線菌孢子懸液(濃度為1 ml 1.0×107個)1 ml 加入100 ml 藻液中(藻細胞濃度為1 ml 1.0×107個)，培養7 d 后檢測溶藻活性，對照組加入1 ml無菌水。將孢子接種于YIM38 液體培養基中培養2 d，無菌過濾培養液，并用無菌水洗滌濾得的菌絲體3 次，充分除去培養基和胞外產物，分別稱取質量為0、0.5 g、1.0 g、1.5 g 和2.0 g 菌絲體加入100 ml 藻液，培養3 d 后檢測溶藻活性，對照組不加菌絲體。

1.5 不同發酵產物的溶藻活性

采用復篩培養基和培養條件進行發酵。發酵結束后4 500 r/min 離心20 min，獲得菌體和發酵上清液。上清液在50 ℃條件下減壓蒸餾，剩余少量水時采用乙酸乙酯連續萃取3 次，合并萃取相，并減壓蒸餾除去其中的有機溶劑即得胞外產物脂溶性成分，除去萃余相中殘余的有機溶劑后真空冷凍干燥即得胞外產物水溶性成分。將菌絲體用無菌水洗滌3 次，濾干水后用丙酮浸泡，于-20 ℃下處理24 h，再于40 ℃水浴中超聲破壁30 min 后過濾，濾液50℃下減壓蒸餾除去丙酮，剩余少量水后按照上清液的處理方法處理，得到胞內脂溶性物質和水溶性物質。取以上4 個組分分別加入100 ml 藻液中，樣品終濃度為100 μg/ml，培養3 d 后檢測溶藻活性。設2 個對照組，分別加2 ml 發酵上清液和2 ml 無菌水。

1.6 溶藻活性成分的穩定性研究

取發酵上清液分別進行以下處理:(1)水浴加熱處理2 h，處理溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃;(2)pH 值處理，將樣品pH 值用1 mol/L 的NaOH 和鹽酸溶液分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 和12.0，50 ℃水浴處理2 h 回調到原始pH 值，并用細菌濾器過濾;(3)將發酵上清液置于無菌培養皿中，在紫外線254 nm 處理2 h(樣品與光源距離15 cm)。取各處理樣品2 ml 加入100 ml 藻液(藻細胞濃度為1 ml 1.0×107個)，培養3 d 后檢測溶藻活性。對照組加2 ml 無菌水。

1.7 溶藻活性成分對銅綠微囊藻生長曲線的影響

在藻液(1 ml 4.0×106個)中加入1%(體積比)的發酵上清液，光照培養，每2 d 取樣1 次，并用血球計數板計數藻細胞數量，共培養40 d，以培養時間為橫坐標，藻細胞數量為縱坐標，繪制藻細胞生長曲線。對照組加1%(體積比)的無菌水。

1.8 溶藻放線菌JXJ-0110 的16S rDNA 序列分析［27］

采用酶解法提取基因組DNA，用細菌通用引物PA(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和PB(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')進行PCR 擴增，PCR 反應體系(總體積為50.0 μl，包含10×Buffer 5.0 μl、dNTP 4.0 μl、PA 1.0 μl、PB 1.0 μl、Taq酶0.3 μl，雙蒸水37.7 μl、DNA 模板1.0 μl)，循環參數為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存24 h。PCR 反應完畢后利用0.8%(質量體積比)瓊脂糖凝膠檢測擴增結果，送檢序列，并將其16S rDNA序列在GenBank 核酸序列數據庫中進行序列同源性比較，用MEGA4 軟件進行Neighbor-joining 法構建系統進化樹。

2 結果

2.1 溶藻放線菌菌株的篩選

試驗結果表明，放線菌JXJ-0110 具有較強的溶藻活性，直徑為5.0 mm 的菌落在藻平板上形成直徑達30.0 mm 的溶藻圈;在藻液中加入2%(體積比)的發酵上清液，3 d 后銅綠微囊藻藻液綠色消失，變成黃色，葉綠素a 含量為0.280 mg/L，僅為對照組的11.6%，溶藻效率達到88.4%。

2.2 放線菌孢子和菌絲體的溶藻活性

試驗結果表明，放線菌JXJ-0110 孢子萌發時具有一定的溶藻活性，與對照組相比，葉綠素a 的去除率為8.5%，這可能是放線菌孢子萌發后與藻細胞競爭營養成分，并產生微量溶藻活性物質，影響藻細胞生長，但由于藻培養基缺乏有機碳源，因此放線菌孢子萌發后難以迅速生長，短期內不會對藻細胞生長造成大的影響。

放線菌JXJ-0110 的菌絲體具有較好的溶藻活性(圖1)，且呈劑量關系，在100 ml(1 ml 1.0×107個)藻液中加入鮮質量為0.5 g 的菌絲體，3 d 后葉綠素a 的去除率為60.5%，當菌絲體鮮質量為2.0 g 時，去除率達91.2%(圖1)。菌絲體溶藻的原因可能包括以下幾點:(1)菌絲體胞內積累的中間代謝產物繼續轉變為溶藻活性物質，并釋放到胞外殺死藻細胞;(2)利用溶解死亡的藻細胞為碳源生長，和藻細胞競爭有限的氮營養元素，從而影響藻細胞生長;(3)菌絲體本身對藻細胞具有一定的絮凝作用，導致藻細胞成團，從而影響藻細胞生長;(4)菌絲體自溶，釋放出胞內溶藻活性物質影響藻細胞生長。

2.3 不同發酵產物的溶藻活性

試驗結果(圖2)表明，胞外產物水溶性成分和胞內產物脂溶性成分均具有較好的溶藻活性，藻液中加入濃度為100 μg/ml 的樣品時，3 d 后葉綠素a的含量分別為0.228 mg/L 和0.336 mg/L，與對照組(2.411 mg/L)相比，葉綠素a 的去除率分別為90.5%和86.1%。

圖1 放線菌JXJ-0110 菌絲體的溶藻活性Fig.1 Alage-lysing activity of mycelia of strain JXJ-0110

圖2 放線菌JXJ-0110 不同代謝產物的溶藻活性Fig.2 Alage-lysing activities of different metabolites from strain JXJ-0110

2.4 發酵產物的穩定性

試驗結果(圖3)表明，在供試所有溫度下，放線菌JXJ-0110 代謝產物均能極顯著影響藻液葉綠素a的含量(P＜0.01);隨著處理溫度的升高，放線菌JXJ-0110 代謝產物的溶藻活性呈下降趨勢，30 ℃時葉綠素a 的去除率為88.4%，而100 ℃時為64.7%。但溶藻活性總體上對溫度相對較穩定，當處理溫度在90 ℃以下時，葉綠素a 的去除率在82%以上，活性喪失約為7%左右。由于蛋白質在高溫條件下很容易變性失活，因此，該菌產生的活性成分可能主要是小分子物質。

試驗結果(圖4)表明，放線菌JXJ-0110 代謝產物在pH 3 ～11 時葉綠素a 的去除率均在71%以上，在pH 6 ～10 時，超過82%，其中pH 8 時去除率最高，超過88%(pH 未處理組為88.4%)。通過對各三角瓶中發酵原液的pH 值檢測發現，發酵原液的pH 值均在8 左右。隨著pH 值進一步升高，溶藻活性明顯下降，當pH 值從11 增加到12 時，葉綠素a 的去除率由71.6%下降到56.1%。

圖3 溫度處理對放線菌JXJ-0110 代謝產物溶藻活性的影響Fig.3 Alage-lysing activities of metabolites from strain JXJ-0110 treated at different temperatures

圖4 不同pH 值處理后JXJ-0110 代謝產物的溶藻活性Fig.4 Alage-lysing activities of metabolites from strain JXJ-0110 treated with different pH values

試驗結果顯示，放線菌JXJ-0110 代謝產物經紫外線254 nm 處理2 h 后，與對照組相比，葉綠素a的去除率為86.4%，這說明該菌產生的溶藻活性成分對紫外線具有較好的穩定性。

2.5 發酵產物對銅綠微囊藻生長曲線的影響

試驗結果(圖5)表明，放線菌JXJ-0110 代謝產物加入藻液后，藻細胞數量迅速下降，并一直維持在一個較低的水平(1 ml 0.21×107個左右)。而對照組藻細胞生長曲線具有單細胞微生物生長曲線的典型特征，即由延滯期、對數期、穩定期和衰亡期組成，1 ～8 d 為延滯期，藻細胞數量由1 ml 0.4×107個 增長到1 ml 1.0×107個;8 ～22 d 為對數期，藻細胞由1 ml 1.0×107個增長到10.3×107個;22 ～36 d 為穩定期，藻細胞數量在1 ml 10×107～11×107個;36 d 后進入衰亡期，藻細胞數量明顯下降。

圖5 放線菌JXJ-0110 代謝產物對銅綠微囊藻生長曲線的影響Fig.5 The influence of metabolites from strain JXJ-0110 on the growth of M.aeruginosa cells

2.6 放線菌JXJ-0110 的16S rDNA 基因序列分析

菌株JXJ-0110 的16S rDNA核苷酸序列全長為1 410 bp，在GenBank 數據庫中通過Blast 發現，該菌與Streptomyces shenzhenensis172115T相似性最高，達到99.06%。從GenBank 數據庫中調集相關菌株的16S rRNA基因序列，采用軟件Clustalx 進行比對，通過MEGA4 以Neighbor-joining 法構建系統發育樹(圖6)，發現，該菌株在系統進化樹上與S.shenzhenensis、S.gramineusJR-43T(HM748598)和S.lanatusNBRC 12787T(AB184845)單獨聚在一支，JXJ-0110 與后兩者的相似性分別為97.78% 和97.76%。根據以上結果可以確定，該菌是鏈霉菌屬的成員，但是否是新種尚需其他試驗數據。

圖6 菌株JXJ-0110 及其相關屬種的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of JXJ-0110 and related taxa

3 討論

銅綠微囊藻是水華藍藻中危害最大的藻種之一，也是中國富營養化湖泊藍藻水華的主要藻種，如何有效防治銅綠微囊藻在藍藻水華治理中具有重要意義。

16S rRNA基因序列分析表明，菌株JXJ-0110 是鏈霉菌屬的成員，鏈霉菌是放線菌的優勢類群，是代謝產物最豐富的微生物。目前報道的溶藻放線菌多數為鏈霉菌，諸如不產色鏈霉菌(S.achromogenes)［28］、生暗鏈霉菌(S.phaeofaciens)［9］、寢屋川鏈霉菌(S.neyagawaensis)［29］、灰霉素鏈霉菌(S.griseinus)［30］和脫葉鏈霉菌(S.exfoliatus)［31］等。

然而，Sigee 等［31］研究表明，室內具有良好溶藻效果的菌株，在野外防治效果卻可能不甚理想，其原因包括:(1)水環境(水的理化性質和其他生物等)對拮抗生物的生長速率、數量和拮抗活性等的影響;(2)藍藻在自然水體中對拮抗生物的反應與實驗室中可能不同;(3)這兩類生物在自然水體生態系統中的生態位不同等。這些原因導致藻類和拮抗生物的分離，從而影響其防治效果。因此，拮抗微生物在野外自然水體中要發揮良好的防治效果，就必須在水環境中具有一定的生物量，對水環境的理化性質和其他生物具有一定的耐受性，并能夠處于表層水，和藻類充分接觸，從而發揮溶藻作用。

放線菌的孢子較輕，易于浮在水面，與藻類充分接觸，其萌發后的菌絲可產生溶藻活性成分，又可絮凝藻細胞并使之沉入水底，從而發揮防治效果。

放線菌JXJ-0110 的孢子加入藻液萌發后具有一定的溶藻活性，但由于藻培養基是組合培養基，其中不含有異養微生物可利用的有機碳源，這限制了孢子萌發后的進一步生長和產生溶藻活性成分。自然環境水體中含有一定量的有機物，這些有機物可為萌發的孢子進一步生長和產生溶藻活性成分提供碳源。因此，放線菌JXJ-0110 的孢子對野外水華藍藻可能具有更好的溶藻活性，值得進一步研究。

放線菌JXJ-0110 的菌絲體具有很強的溶藻活性，除了菌絲體自身絮凝藻細胞和競爭藻細胞的氮磷等營養物質的作用外，更主要的原因可能是菌絲體在藻液中繼續產生胞外溶藻活性物質而溶藻，死亡溶解的藻細胞又為菌絲體提供碳氮等營養物質，使菌絲體進一步生長和產生溶藻活性物質，同時，那些自溶死亡的菌絲體還可釋放出胞內脂溶性溶藻活性物質而溶藻。

該菌產生的胞外溶藻活性成分是水溶性物質，水溶性物質在水中的分散性好，可在短時間內與藻細胞充分接觸而將藻細胞迅速殺死。同時，這些活性成分在較高的溫度下穩定性好，在較廣泛的pH值條件下不易失活，對紫外線也具有較好的穩定性，試驗條件下能夠較長時間抑制銅綠微囊藻的生長。以上這些結果說明，放線菌JXJ-0110 及其代謝產物在藍藻水華防治方面具有潛在的價值。

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