體內沃爾巴克氏體(Wolbachia)對寄主雜擬谷盜生殖的調控作用

王阿旻， 程 超， 潘沈元， 明慶磊

(江蘇師范大學生命科學學院，江蘇 徐州221116)

沃爾巴克氏體(Wolbachia)是一類革蘭氏陰性細胞內共生菌，其寄主范圍很廣，存在于昆蟲、蜘蛛和螨等節肢動物體內，是昆蟲體內分布最廣的一種細胞內共生菌，超過65%的昆蟲體內都存在［1］。目前檢測寄主體內Wolbachia的存在，一般是通過PCR 擴增和分析Wolbachia的基因(如16S rRNA、ftsZ、wsp等)，而不是通過傳統的微生物學方法進行檢測，原因是Wolbachia很難在寄主體外進行分離、培養與鑒定［2］。

Wolbachia影響寄主的生殖，如誘導胞質不親和、孤雌生殖、雄性的雌性化、雄性胚胎致死和增強雌性繁殖力與雄性生育力等［3-4］。另外，Wolbachia也可能影響寄主的交配。有研究結果表明，一些體內存在Wolbachia的寄主個體趨向于選擇體內也存在Wolbachia的配偶個體進行交配，這可能是為了避免Wolbachia引起的交配后生殖不親和［5-8］。

雜擬谷盜(Tribolium confusumJac.du Val.)屬鞘翅目擬步行蟲科擬谷盜屬，是一種重要的世界性儲糧害蟲，在中國大部分地區都有分布［9］。其成蟲和幼蟲可直接為害面粉、麩皮、米糠、禾谷類籽實等，此外，成蟲體表的臭腺可分泌含苯醌等致癌物質的臭液，使被害物結塊、變色、發臭而不能食用，常給農業生產帶來巨大的經濟損失［10］。目前，施用化學農藥是防治雜擬谷盜的重要手段，但由于化學殺蟲劑的大量使用，使雜擬谷盜的耐藥性逐漸提高、防治更加困難，因此探尋綠色、安全、高效的生物防治方法將是今后雜擬谷盜綜合防治研究的主要策略［11］。國外有研究結果表明雜擬谷盜體內存在Wolbachia［12］，Wolbachia可以增強雄性雜擬谷盜的交配能力［13］，但目前尚不清楚其對雜擬谷盜生殖的調控作用。本研究首先利用PCR 技術檢測所用雜擬谷盜種群體內是否存在Wolbachia，然后通過抗生素處理對其進行去除，并測定Wolbachia對雜擬谷盜交配和生殖的影響，為今后可能利用Wolbachia對雜擬谷盜進行生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

雜擬谷盜由河南工業大學糧油食品學院魯玉杰教授提供，置于溫度為29 ℃、相對濕度70%的恒溫恒濕培養箱中，在小麥全麥面粉(山東濰坊風箏面粉廠生產)中進行繁殖擴群。所用試蟲在蛹期鑒別雌雄并分開飼養，羽化后待用。

1.2 雜擬谷盜體內Wolbachia 的PCR 檢測

1.2.1 DNA 提取 將單頭試蟲放在研缽中，加入液氮冷凍后研磨成細末，用異硫氰酸胍法［14］提取總DNA，室溫晾干后懸浮于20 μl 滅菌雙蒸水中，4 ℃保存備用。

1.2.2 PCR 擴增與測序wsp基因的擴增引物為:81F (5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3') 和691R (5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3')［15］;ftsZ基因的擴增引物為:ftsZ-F (5'-TACTGACTGTTGGAGTTGTAACTAAGCCGT-3')和ftsZ-R (5'-TGCCAGTTGCAAGAACAGAAACTCTAACTC-3')［16］。PCR反應在BIOER 擴增儀上進行:94 ℃預變性5 min;94℃變性50 s，50 ℃(wsp)/ 62 ℃(ftsZ)退火45 s，72 ℃延伸60 s ，33 個循環;72 ℃延伸10 min。PCR 反應體系總體積是30 μl，其中包括 2×PCR Reaction Mix(TIANGEN)15 μl，TaqDNA 聚合酶0.24 μl，DNA 模板1.2 μl，上游/下游引物(10 mol/L)各1.2 μl，用滅菌雙蒸水補足體積。取PCR 擴增產物2 μl 在0.75%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，然后送至上海英駿生物技術有限公司測序。擴增引物和測序引物由上海捷瑞生物工程技術服務有限公司合成。共對20 頭雌、雄雜擬谷盜體內的Wolbachia進行了檢測。

1.3 雜擬谷盜體內Wolbachia 的去除

在研缽中將四環素片(海南制藥廠生產)研磨成粉末，把粉末加到小麥全麥面粉中配制成0.3%四環素面粉。將羽化后2 周的雌、雄雜擬谷盜各400 頭放到盛有15 g 四環素面粉的塑料杯(高9 cm，口徑6 cm，底徑5 cm)中飼養1 個月，每個杯中放40 頭，用于獲取Wolbachia陰性(w-，體內不存在Wolbachia)試蟲;同時將羽化后2 周的雌、雄雜擬谷盜各400 頭放到盛有15 g 全麥面粉的塑料杯(同上)中飼養1 個月，每個杯中放40 頭，作為對照，用于獲取Wolbachia陽性(w+，體內存在Wolbachia)試蟲。分別選取四環素面粉飼養的雌、雄雜擬谷盜各4 頭，通過PCR 擴增wsp基因檢測寄主體內Wolbachia的去除情況。

1.4 Wolbachia 對雄性雜擬谷盜交配選擇的影響

試驗分為雄性無選擇交配組(1♂w+對1♀w+、1♂w+對1♀w-、1♂w-對1♀w+、1♂w-對1♀w-共4 個組合)和雄性有選擇交配組(1♂w+對1♀w+和1♀w-、1♂w-對1♀w+和1♀w-共2 個組合)，每個組合設置45個重復。將雌、雄成蟲放在一個底部帶有劃痕的塑料培養皿交配場(直徑3.5 cm)中，在30 min 內觀察并記錄它們的接觸、爬跨和交配行為。試驗環境溫度為25 ℃，相對濕度70%。

1.5 Wolbachia 對雄性雜擬谷盜交配力和受精率的影響

試驗分為對照組(1♂w+對5♀w+)和試驗組(1♂w-對5♀w+)，每個組設置41 個重復。將1 頭受試雄蟲與5 頭處女雌蟲置于交配場(同上)中，當雄蟲與其中一頭雌蟲接觸、爬跨和交配結束后，立即用自制抽吸瓶將交配過的雌蟲吸出并轉移到一個裝有小麥面粉的小玻璃瓶中，然后將另一頭處女雌蟲補充到交配場中，始終保持交配場中有5 頭雌蟲的恒定交配密度，記錄在15 min 內交配的雌蟲個數。交配過的雌蟲單個置于裝有全麥面粉的小玻璃瓶中，在恒溫恒濕箱中培養，2 周后檢查瓶中是否有幼蟲，并做記錄，若有幼蟲則表示交配過的雌蟲受精成功。交配力以雄蟲在15 min 內平均每分鐘交配的雌蟲數表示，受精率以受精成功的雌蟲個數占交配雌蟲個數的百分比表示。

1.6 Wolbachia 對雜擬谷盜生殖親和性的影響

試驗分為4 個組合(1♂w+×1♀w+、1♂w+×1♀w-、1♂w-×1♀w+、1♂w-×1♀w-)，每個組合設置11 個重復。將1 對雌雄成蟲分別放入裝有小麥全麥面粉的小玻璃瓶中自由交配3 d，然后將雌蟲轉移到另一個裝有小麥全麥面粉的小玻璃瓶中，記錄每天的產卵數，共計10 d。將每天收集的卵放入裝有全麥面粉的1.5 ml 帶蓋Eppendorf 管中(蓋上扎有3 個小孔)，收卵后2 周檢查每個管中的幼蟲數，待其化蛹后鑒別雌雄并計數。

1.7 數據統計與分析

使用SPSS13.0 軟件，對交配選擇數據進行卡方檢驗分析;對交配力和受精率數據進行獨立樣本T 檢驗分析;對生殖親和性數據進行單因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗法進行均數間的多重比較。

2 結果

2.1 雜擬谷盜體內Wolbachia 的基因檢測和序列比對

利用wsp基因和ftsZ 基因的特異性引物從雜擬谷盜總DNA 中分別PCR 擴增到1 段大約600 bp 和550 bp 的Wolbachia基因片段(圖1)。wsp和ftsZ基因片段的測序結果與GenBank 已提交序列完全一致，可見所用雜擬谷盜種群體內存在Wolbachia。wsp和ftsZ基因序列已提交GenBank 數據庫，登錄號分別為KC305360 和KC305361。

圖1 雜擬谷盜體內Wolbachia 的基因PCR 擴增產物電泳圖Fig.1 Amplification patterns of Wolbachia genes from Tribolium confusum by PCR

2.2 雜擬谷盜體內Wolbachia 的去除

提取飼喂0.3%四環素面粉的雜擬谷盜總DNA，從總DNA 中未擴增到wsp基因片段，而從對照組雜擬谷盜總DNA 中擴增到wsp基因片段(圖2)。這說明通過飼喂四環素面粉可以去除雜擬谷盜體內的Wolbachia，從而獲得Wolbachia陰性雜擬谷盜。

2.3 Wolbachia 對雄雜擬谷盜交配選擇的影響

在無選擇交配試驗中，雄雜擬谷盜(♂w+或♂w-)對雌雜擬谷盜(♀w+或♀w-)的行為反應在接觸率、爬跨率和交配率上均沒有顯著性差異(P＞0.05)(表1);在有選擇交配試驗中，雄雜擬谷盜(♂w+或♂w-)對雌雜擬谷盜(♀w+和♀w-)的行為反應在接觸率、爬跨率和交配率上也均沒有顯著性差異(P＞0.05)(表2)。這些結果表明體內存在和不存在Wolbachia的雄雜擬谷盜在交配選擇上均沒有偏向性，Wolbachia對雜擬谷盜的交配選擇沒有影響。

圖2 飼喂普通面粉和四環素面粉后雜擬谷盜體內Wolbachia的wsp 基因PCR 擴增檢測Fig.2 Detection of wsp gene by PCR amplification of Wolbachia in T.confusum fed on ordinary flour and tetracycline flour

表1 感染和未感染Wolbachia 的雄性雜擬谷盜對雌性的無選擇交配行為反應Table 1 No-choice mating behavior of male Wolbachia-infected(w+)and Wolbachia-free(w-)T.confusum

表2 雄性雜擬谷盜對感染和未感染Wolbachia 的雌性的選擇交配行為反應Table 2 Mate-choice behavior of Wolbachia-infected(w+)and Wolbachia-free(w-)male T.confusum

2.4 Wolbachia 對雄性雜擬谷盜交配力和受精率的影響

兩種雄雜擬谷盜(♂w+和♂w-)在交配力和受精率均沒有顯著性差異(P＞0.05)(表3)，這表明Wolbachia對雄性雜擬谷盜的交配力和受精率沒有影響。

表3 感染和未感染Wolbachia 的雄性雜擬谷盜對雌性的交配力和受精率Table 3 Mating capability and fertility rates of Wolbachia-infected(w+)and Wolbachia-free(w-)male T.confusum

2.5 Wolbachia 對雜擬谷盜生殖的影響

Wolbachia對雜擬谷盜生殖影響的試驗結果見表4。在產卵數上4 個交配組合沒有顯著差異(P＞0.05)，但在卵孵化率上，♂w+×♀w+和♂w-×♀w+組合較高(超過80%)，♂w-×♀w-組合較低(低于10%)，而♂w+×♀w-組合的卵都沒有進一步發育(孵化率為0)，且前兩個組合(♂w+×♀w+和♂w-×♀w+)與后兩個組合(♂w-×♀w-和♂w+×♀w-)的孵化率存在顯著差異(P＜0.05)。♂w+×♀w+和♂w-×♀w+組合的平均化蛹率(蛹數/幼蟲數)顯著高于♂w-×♀w-組合(P＜0.05)。雌性比(雌蛹數/總蛹數)測定結果顯示，來自♂w+×♀w+和♂w-×♀w+組合的后代中雌雄比正常(各占50%)，♂w-×♀w-組合的后代雌雄比不正常(雌少雄多)，兩者雌性比差異顯著(P＜0.05)，說明在從卵到成蟲的發育過程中♂w+×♀w+和♂w-×♀w+組合沒有雄性或雌性致死，而♂w-×♀w-組合存在雌性致死。由此可見，Wolbachia對雜擬谷盜的生殖有影響。

表4 感染和未感染Wolbachia 的雜擬谷盜不同交配組合的生殖親和性Table 4 Cross compatibility betweenWolbachia-infected (w+)and Wolbachia-free(w-)T.confusum

3 討論

本研究發現Wolbachia不僅對雄雜擬谷盜的交配選擇沒有影響，而且對雄雜擬谷盜的交配力和受精率也沒有影響。黑腹果蠅(Drosophila melano-gaster)種群間的行為隔離與Wolbachia有關，原因是Wolbachia可能改變了寄主分泌的性信息素成分從而影響了其交配選擇［6］。Gazla 等［8］研究發現，雌性黑腹果蠅趨向于選擇與自己具有相同Wolbachia感染狀況的雄性，而雄性黑腹果蠅則是隨機地選擇與雌性交配。與此發現相反，Champion 等［7］曾報道黑腹果蠅沒有表現出明顯的與Wolbachia有關的配偶選擇偏好，原因是如果Wolbachia感染不能引起昆蟲寄主顯著性的生理生化變化，昆蟲個體將難于做出與配偶的Wolbachia感染狀況有關的交配選擇。Champion 等［17］發現感染Wolbachia的雄果蠅比未感染者的交配力更強。Wade 等［13］發現，與未感染Wolbachia的雄雜擬谷盜相比，感染了Wolbachia的雄雜擬谷盜與雌雜擬谷盜的交配次數更多，顯然Wolbachia可以增強雄性雜擬谷盜的交配能力，此報道與本研究結果不一致，這可能是所用雜擬谷盜種群不同或所用種群感染Wolbachia密度的不同而導致的。

雜擬谷盜♂w+×♀w-交配組合所產卵的孵化率為0，說明早期胚胎發育終止，由此推測體內存在Wolbachia的雄雜擬谷盜和體內不存在Wolbachia的雌雜擬谷盜交配后在生殖上其精子與卵子胞質不親和。雜擬谷盜♂w-×♀w+交配組合的孵化率和化蛹率高，雌雄性比為1 ∶1，說明早期胚胎、幼蟲和蛹的發育正常，表明在生殖上其精子與卵子胞質親和。由此可見，雜擬谷盜體內Wolbachia誘導的生殖不親和屬于典型的單向不親和，即體內有Wolbachia的雄性與沒有Wolbachia的雌性間的生殖不親和，而反向是親和的。生殖不親和性的產生可能是由于Wolbachia誘導了某種蛋白質的產生，從而影響了受精后的第1 次有絲分裂進程［18-19］。

雜擬谷盜♂w+×♀w-交配組合在生殖上其精子與卵子胞質完全不親和。雜擬谷盜♂w-×♀w-交配組合的孵化率和化蛹率低，說明早期胚胎能發育，但在發育過程中大部分胚胎、幼蟲和蛹死亡，表明在生殖上其精子與卵子胞質不完全親和。♂w+×♀w-交配組合的生殖不親和性比♂w-×♀w-交配組合的生殖不親和性表現強烈，生殖不親和的表現強度與很多因素有關，如Wolbachia系統、Wolbachia的密度、寄主的基因型、飼養環境溫度等［20-24］。

雜擬谷盜♂w+×♀w+和♂w-×♀w+交配組合的孵化率和化蛹率高，雌雄比為1 ∶1，說明早期胚胎、幼蟲和蛹的發育正常，表明在生殖上其精子與卵子胞質完全親和。生殖親和性顯然有2 個組成系統的參與:精子中共生細菌的“修飾”和受精卵中共生細菌的“營救”［25］。根據這個模型，精巢內的共生細菌對發育中的精子進行“修飾”，只有卵中存在相同的共生細菌才能“營救”這種“修飾”，如果沒有“營救”，就會導致卵和精子的胞質不親和。

本研究結果表明雜擬谷盜體內存在Wolbachia，通過飼喂四環素面粉能去除雜擬谷盜體內的Wolbachia，從而獲得Wolbachia陰性雜擬谷盜;Wolbachia對雜擬谷盜交配選擇和交配能力沒有影響，但是對其交配后生殖親和性有影響。鑒于此，Wolbachia具有生物防治的潛在意義，可能具有重要的應用價值。

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