大鯢感染虹彩病毒的診斷和治療

賈秋紅

摘 要：2013年7月，陜西省漢中某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生以大鯢體表和四肢多處潰爛并伴有出血為特征的疾病，染病大鯢大量死亡。經(jīng)臨床觀察、病理解剖及實驗室檢測，最后確診病原為大鯢虹彩病毒。通過采取綜合防治措施，養(yǎng)殖場大鯢疫情得到有效控制。

關(guān)鍵詞：大鯢虹彩病毒；診斷；防治

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，有很重要的科研價值及藥用和營養(yǎng)價值。近年來，隨著大鯢人工養(yǎng)殖不斷發(fā)展，各種疾病也不斷暴發(fā)，尤其是病毒性疾病，給養(yǎng)殖戶造成慘重的經(jīng)濟損失。2013年7月，陜西省商洛市洛南縣某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、充血及出血為特征的疾病，經(jīng)過臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，診斷病原為大鯢虹彩病毒。現(xiàn)將診治結(jié)果報道如下。

1 基本情況及臨床癥狀

2013年7月，陜西省商洛某大鯢養(yǎng)殖場大鯢突發(fā)異常，行動緩慢，攝食減少，前、后肢嚴重腫脹、潰爛且局部出血，采用肌肉注射青霉素和慶大霉素、頭孢噻吩以及中藥浸泡等治療措施均無效，并在治療過程中陸續(xù)死亡，且隨著時間的推移，死亡數(shù)量越來越大。

2 病理剖檢

對病死大鯢進行病理剖檢，其結(jié)果如下：病死大鯢頭部、前、后肢、尾部嚴重潰爛、腫脹，頸部、腹部、下頜均有大量出血點，腹腔內(nèi)有淡黃色的積水，肝臟腫大且松軟無彈性，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大有白點。

3 實驗室檢測

3.1 患病大鯢虹彩病毒的細胞擴增檢測

取病死大鯢的肝、腎組織各0.5 g于研磨器中加入2 mL無菌水在低溫下研磨制成懸液，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，放入-80 ℃反復凍融3次，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為病毒提取液備用。取一瓶已培養(yǎng)了48 h的EPC細胞，棄去培養(yǎng)液，吸取0.2 mL病毒提取液接種到此培養(yǎng)瓶中，吸附1 h，加入含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液于25 ℃培養(yǎng)，同時做空白對照，24 h有CPE反應(yīng)，72 h后CPE反應(yīng)強烈，細胞已完全脫落，確定患病大鯢為病毒感染，見圖1和圖2。

3.2 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測

取前面已經(jīng)制備的病毒提取液和陽性對照病毒株（陽性對照病毒株選用本實驗室分離的大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV））。按照病毒DNA小劑量抽提試劑盒的說明書提取組織和細胞分離病毒的DNA。

根據(jù)GenBank已發(fā)表的蛙病毒屬的代表種FV3主衣殼蛋白（MCP）基因高度保守區(qū)序列（登錄號：AY548484）設(shè)計引物用于檢測，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。序列如下：

CGS-T-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；

CGS-T-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′；

總體積為25 μL的反應(yīng)體系為：0.25 μL TaKaRa Ex Taq（5U/μL），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），0.25 nmol/L dNTPs 1 μL，引物 （50 pmol/L）各0.5 μL，DNA模板3 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預處理3 min，進行30個循環(huán)，每個循環(huán)反應(yīng)包括 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)完成后，72 ℃充分延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統(tǒng)拍照，病鯢病毒提取液檢測結(jié)果呈陽性，確定患病大鯢為虹彩病毒（CGSIV）感染，見圖3。

經(jīng)過流行病學調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，該養(yǎng)殖場發(fā)生的以大鯢體表和四肢腫大、多處潰爛、充血、出血為特征的疾病，診斷為大鯢虹彩病毒（CGSIV）感染的病毒病。

1：標準病毒擴增結(jié)果；2：陰性對照；3：病鯢病毒提取液擴增結(jié)果。4 診斷結(jié)果圖3 結(jié)果與標準病毒株P(guān)CR檢測對比

5 防治措施

確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行嚴格隔離，對養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖水體及養(yǎng)殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。對餌料魚用高錳酸鉀進行浸泡，對未患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗0.2 mL/kg，每隔2周注射一次，連續(xù)注射3次。對患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，注射量為0.2 mL/kg·次，每隔2周注射一次，連續(xù)注射3次，期間再注射我們自制的中西藥結(jié)合的抗病毒藥物，注射量為2 mL/kg·次，連續(xù)注射三天。用藥一周后死亡數(shù)量逐漸減少。兩周后，已無死亡現(xiàn)象，發(fā)病的大鯢部分開始攝食，疫情得到了有效的遏制。

6 討論

該養(yǎng)殖場大鯢被確診為大鯢虹彩病毒感染，大鯢虹彩病毒（CGS1V）是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus中的一種，為雙鏈DNA 病毒，其感染率和死亡率都很高；一旦發(fā)病，只能通過注射一些增強免疫和消炎的藥物，治標不治本，往往會給養(yǎng)殖戶帶來巨大的損失。要想遏制病毒病的發(fā)生最有效的方法是提前注射疫苗。目前我們已經(jīng)研制成功針對大鯢虹彩病毒的滅活疫苗。通過注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，可以有效預防大鯢虹彩病毒病的發(fā)生，降低養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖風險。

在對該養(yǎng)殖場發(fā)病大鯢進行病毒檢測時，我們選用的檢測方法有細胞擴增和PCR檢測兩種。通過細胞擴增檢測，即使很微量的病毒量也可以檢測出，但此方法只能確定是病毒感染而不能確定是那種病毒感染，而PCR檢測方法通過與已知標準病毒進行對照，可以確定感染病毒的具體種類，但此方法由于檢測過程較為繁瑣，常會出現(xiàn)“假陽性”或“假陰性”結(jié)果。通過兩種方法的結(jié)合使用，揚長辟短可以大大提高檢測虹彩病毒的準確性。

摘 要：2013年7月，陜西省漢中某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生以大鯢體表和四肢多處潰爛并伴有出血為特征的疾病，染病大鯢大量死亡。經(jīng)臨床觀察、病理解剖及實驗室檢測，最后確診病原為大鯢虹彩病毒。通過采取綜合防治措施，養(yǎng)殖場大鯢疫情得到有效控制。

關(guān)鍵詞：大鯢虹彩病毒；診斷；防治

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，有很重要的科研價值及藥用和營養(yǎng)價值。近年來，隨著大鯢人工養(yǎng)殖不斷發(fā)展，各種疾病也不斷暴發(fā)，尤其是病毒性疾病，給養(yǎng)殖戶造成慘重的經(jīng)濟損失。2013年7月，陜西省商洛市洛南縣某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、充血及出血為特征的疾病，經(jīng)過臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，診斷病原為大鯢虹彩病毒。現(xiàn)將診治結(jié)果報道如下。

1 基本情況及臨床癥狀

2013年7月，陜西省商洛某大鯢養(yǎng)殖場大鯢突發(fā)異常，行動緩慢，攝食減少，前、后肢嚴重腫脹、潰爛且局部出血，采用肌肉注射青霉素和慶大霉素、頭孢噻吩以及中藥浸泡等治療措施均無效，并在治療過程中陸續(xù)死亡，且隨著時間的推移，死亡數(shù)量越來越大。

2 病理剖檢

對病死大鯢進行病理剖檢，其結(jié)果如下：病死大鯢頭部、前、后肢、尾部嚴重潰爛、腫脹，頸部、腹部、下頜均有大量出血點，腹腔內(nèi)有淡黃色的積水，肝臟腫大且松軟無彈性，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大有白點。

3 實驗室檢測

3.1 患病大鯢虹彩病毒的細胞擴增檢測

取病死大鯢的肝、腎組織各0.5 g于研磨器中加入2 mL無菌水在低溫下研磨制成懸液，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，放入-80 ℃反復凍融3次，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為病毒提取液備用。取一瓶已培養(yǎng)了48 h的EPC細胞，棄去培養(yǎng)液，吸取0.2 mL病毒提取液接種到此培養(yǎng)瓶中，吸附1 h，加入含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液于25 ℃培養(yǎng)，同時做空白對照，24 h有CPE反應(yīng)，72 h后CPE反應(yīng)強烈，細胞已完全脫落，確定患病大鯢為病毒感染，見圖1和圖2。

3.2 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測

取前面已經(jīng)制備的病毒提取液和陽性對照病毒株（陽性對照病毒株選用本實驗室分離的大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV））。按照病毒DNA小劑量抽提試劑盒的說明書提取組織和細胞分離病毒的DNA。

根據(jù)GenBank已發(fā)表的蛙病毒屬的代表種FV3主衣殼蛋白（MCP）基因高度保守區(qū)序列（登錄號：AY548484）設(shè)計引物用于檢測，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。序列如下：

CGS-T-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；

CGS-T-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′；

總體積為25 μL的反應(yīng)體系為：0.25 μL TaKaRa Ex Taq（5U/μL），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），0.25 nmol/L dNTPs 1 μL，引物 （50 pmol/L）各0.5 μL，DNA模板3 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預處理3 min，進行30個循環(huán)，每個循環(huán)反應(yīng)包括 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)完成后，72 ℃充分延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統(tǒng)拍照，病鯢病毒提取液檢測結(jié)果呈陽性，確定患病大鯢為虹彩病毒（CGSIV）感染，見圖3。

經(jīng)過流行病學調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，該養(yǎng)殖場發(fā)生的以大鯢體表和四肢腫大、多處潰爛、充血、出血為特征的疾病，診斷為大鯢虹彩病毒（CGSIV）感染的病毒病。

1：標準病毒擴增結(jié)果；2：陰性對照；3：病鯢病毒提取液擴增結(jié)果。4 診斷結(jié)果圖3 結(jié)果與標準病毒株P(guān)CR檢測對比

5 防治措施

確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行嚴格隔離，對養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖水體及養(yǎng)殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。對餌料魚用高錳酸鉀進行浸泡，對未患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗0.2 mL/kg，每隔2周注射一次，連續(xù)注射3次。對患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，注射量為0.2 mL/kg·次，每隔2周注射一次，連續(xù)注射3次，期間再注射我們自制的中西藥結(jié)合的抗病毒藥物，注射量為2 mL/kg·次，連續(xù)注射三天。用藥一周后死亡數(shù)量逐漸減少。兩周后，已無死亡現(xiàn)象，發(fā)病的大鯢部分開始攝食，疫情得到了有效的遏制。

6 討論

該養(yǎng)殖場大鯢被確診為大鯢虹彩病毒感染，大鯢虹彩病毒（CGS1V）是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus中的一種，為雙鏈DNA 病毒，其感染率和死亡率都很高；一旦發(fā)病，只能通過注射一些增強免疫和消炎的藥物，治標不治本，往往會給養(yǎng)殖戶帶來巨大的損失。要想遏制病毒病的發(fā)生最有效的方法是提前注射疫苗。目前我們已經(jīng)研制成功針對大鯢虹彩病毒的滅活疫苗。通過注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，可以有效預防大鯢虹彩病毒病的發(fā)生，降低養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖風險。

在對該養(yǎng)殖場發(fā)病大鯢進行病毒檢測時，我們選用的檢測方法有細胞擴增和PCR檢測兩種。通過細胞擴增檢測，即使很微量的病毒量也可以檢測出，但此方法只能確定是病毒感染而不能確定是那種病毒感染，而PCR檢測方法通過與已知標準病毒進行對照，可以確定感染病毒的具體種類，但此方法由于檢測過程較為繁瑣，常會出現(xiàn)“假陽性”或“假陰性”結(jié)果。通過兩種方法的結(jié)合使用，揚長辟短可以大大提高檢測虹彩病毒的準確性。

摘 要：2013年7月，陜西省漢中某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生以大鯢體表和四肢多處潰爛并伴有出血為特征的疾病，染病大鯢大量死亡。經(jīng)臨床觀察、病理解剖及實驗室檢測，最后確診病原為大鯢虹彩病毒。通過采取綜合防治措施，養(yǎng)殖場大鯢疫情得到有效控制。

關(guān)鍵詞：大鯢虹彩病毒；診斷；防治

大鯢（Andrias davidianus），俗稱娃娃魚，屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀有尾兩棲動物，為國家二級保護動物，有很重要的科研價值及藥用和營養(yǎng)價值。近年來，隨著大鯢人工養(yǎng)殖不斷發(fā)展，各種疾病也不斷暴發(fā)，尤其是病毒性疾病，給養(yǎng)殖戶造成慘重的經(jīng)濟損失。2013年7月，陜西省商洛市洛南縣某大鯢養(yǎng)殖場發(fā)生了以大鯢體表和四肢多處潰爛、充血及出血為特征的疾病，經(jīng)過臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，診斷病原為大鯢虹彩病毒。現(xiàn)將診治結(jié)果報道如下。

1 基本情況及臨床癥狀

2013年7月，陜西省商洛某大鯢養(yǎng)殖場大鯢突發(fā)異常，行動緩慢，攝食減少，前、后肢嚴重腫脹、潰爛且局部出血，采用肌肉注射青霉素和慶大霉素、頭孢噻吩以及中藥浸泡等治療措施均無效，并在治療過程中陸續(xù)死亡，且隨著時間的推移，死亡數(shù)量越來越大。

2 病理剖檢

對病死大鯢進行病理剖檢，其結(jié)果如下：病死大鯢頭部、前、后肢、尾部嚴重潰爛、腫脹，頸部、腹部、下頜均有大量出血點，腹腔內(nèi)有淡黃色的積水，肝臟腫大且松軟無彈性，膽囊充盈，脾臟、腎臟腫大有白點。

3 實驗室檢測

3.1 患病大鯢虹彩病毒的細胞擴增檢測

取病死大鯢的肝、腎組織各0.5 g于研磨器中加入2 mL無菌水在低溫下研磨制成懸液，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，放入-80 ℃反復凍融3次，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為病毒提取液備用。取一瓶已培養(yǎng)了48 h的EPC細胞，棄去培養(yǎng)液，吸取0.2 mL病毒提取液接種到此培養(yǎng)瓶中，吸附1 h，加入含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液于25 ℃培養(yǎng)，同時做空白對照，24 h有CPE反應(yīng)，72 h后CPE反應(yīng)強烈，細胞已完全脫落，確定患病大鯢為病毒感染，見圖1和圖2。

3.2 患病大鯢虹彩病毒的PCR檢測

取前面已經(jīng)制備的病毒提取液和陽性對照病毒株（陽性對照病毒株選用本實驗室分離的大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV））。按照病毒DNA小劑量抽提試劑盒的說明書提取組織和細胞分離病毒的DNA。

根據(jù)GenBank已發(fā)表的蛙病毒屬的代表種FV3主衣殼蛋白（MCP）基因高度保守區(qū)序列（登錄號：AY548484）設(shè)計引物用于檢測，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。序列如下：

CGS-T-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；

CGS-T-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′；

總體積為25 μL的反應(yīng)體系為：0.25 μL TaKaRa Ex Taq（5U/μL），2.5 μL 10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），0.25 nmol/L dNTPs 1 μL，引物 （50 pmol/L）各0.5 μL，DNA模板3 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預處理3 min，進行30個循環(huán)，每個循環(huán)反應(yīng)包括 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)完成后，72 ℃充分延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統(tǒng)拍照，病鯢病毒提取液檢測結(jié)果呈陽性，確定患病大鯢為虹彩病毒（CGSIV）感染，見圖3。

經(jīng)過流行病學調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理解剖及實驗室檢測，該養(yǎng)殖場發(fā)生的以大鯢體表和四肢腫大、多處潰爛、充血、出血為特征的疾病，診斷為大鯢虹彩病毒（CGSIV）感染的病毒病。

1：標準病毒擴增結(jié)果；2：陰性對照；3：病鯢病毒提取液擴增結(jié)果。4 診斷結(jié)果圖3 結(jié)果與標準病毒株P(guān)CR檢測對比

5 防治措施

確診后，將患病大鯢與健康大鯢進行嚴格隔離，對養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖水體及養(yǎng)殖用具等用聚維酮碘和高錳酸鉀徹底消毒。對餌料魚用高錳酸鉀進行浸泡，對未患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗0.2 mL/kg，每隔2周注射一次，連續(xù)注射3次。對患病大鯢注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，注射量為0.2 mL/kg·次，每隔2周注射一次，連續(xù)注射3次，期間再注射我們自制的中西藥結(jié)合的抗病毒藥物，注射量為2 mL/kg·次，連續(xù)注射三天。用藥一周后死亡數(shù)量逐漸減少。兩周后，已無死亡現(xiàn)象，發(fā)病的大鯢部分開始攝食，疫情得到了有效的遏制。

6 討論

該養(yǎng)殖場大鯢被確診為大鯢虹彩病毒感染，大鯢虹彩病毒（CGS1V）是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus中的一種，為雙鏈DNA 病毒，其感染率和死亡率都很高；一旦發(fā)病，只能通過注射一些增強免疫和消炎的藥物，治標不治本，往往會給養(yǎng)殖戶帶來巨大的損失。要想遏制病毒病的發(fā)生最有效的方法是提前注射疫苗。目前我們已經(jīng)研制成功針對大鯢虹彩病毒的滅活疫苗。通過注射大鯢虹彩病毒滅活疫苗，可以有效預防大鯢虹彩病毒病的發(fā)生，降低養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖風險。

在對該養(yǎng)殖場發(fā)病大鯢進行病毒檢測時，我們選用的檢測方法有細胞擴增和PCR檢測兩種。通過細胞擴增檢測，即使很微量的病毒量也可以檢測出，但此方法只能確定是病毒感染而不能確定是那種病毒感染，而PCR檢測方法通過與已知標準病毒進行對照，可以確定感染病毒的具體種類，但此方法由于檢測過程較為繁瑣，常會出現(xiàn)“假陽性”或“假陰性”結(jié)果。通過兩種方法的結(jié)合使用，揚長辟短可以大大提高檢測虹彩病毒的準確性。