鄰苯二甲醛法(OPA)與高效液相色譜法(HPLC)測定降膽固醇的雙歧桿菌的對比

張汝嬌，何臘平，3，李翠芹，張玲，王猛，朱秋勁

1(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽，550025)2(貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550025)

3(貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽，550025)4(貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

WHO曾預(yù)測，心腦血管疾病到2030年仍是引起死亡的主要原因［1］。而血清中膽固醇過高是引發(fā)冠心病、動(dòng)脈硬化、腦中風(fēng)等心腦血管疾病的重要因素［2］。因此，降低血清中膽固醇的含量則成為目前心血管疾病科學(xué)研究工作的熱點(diǎn)之一。目前，運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化法，特別是運(yùn)用益生菌對膽固醇進(jìn)行直接降解已成為研究的趨勢。

雙歧桿菌是一種具有降低膽固醇作用的腸道益生菌［3］，但不同菌株間降膽固醇作用差異較大，所以一般需先建立體外篩選降膽固醇的模型，然后進(jìn)行雙歧桿菌菌株降膽固醇能力的初步篩選。Bordoni［4］曾發(fā)現(xiàn)1株兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)能在體外吸附膽固醇達(dá)到81 mg/g。陳路清［5］等研究也發(fā)現(xiàn)青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)體外能降低膽固醇在50%左右。

由于膽固醇是不溶于水的物質(zhì)，體外篩選能降膽固醇的雙歧桿菌通常是制備含有膽固醇膠束的培養(yǎng)基，加入菌體培養(yǎng)后測其膽固醇的值進(jìn)行判斷。目前常用于測定膽固醇的方法有化學(xué)法，包括硫酸鐵銨法［6］、鄰苯二甲醛(OPA)法［7］;色譜法，包括高效液相色譜(HPLC)［8］、氣相色譜(GC)［9］;色質(zhì)聯(lián)用法，包括氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)［10-11］;以及運(yùn)用分子印跡聚合物為填料的固相萃取技術(shù)的物理法［12］等等。化學(xué)法簡單易操作，色譜及質(zhì)譜法則對實(shí)驗(yàn)儀器配置要求高，酶法對測定膽固醇特異性強(qiáng)，主要用于血清中膽固醇的檢測，而分子印跡技術(shù)尚在探索中條件不成熟。但考慮前期大量體外篩選菌株的情況，本實(shí)驗(yàn)選擇了常用的化學(xué)法OPA法與色譜法HPLC法對實(shí)驗(yàn)所保藏的5株雙歧桿菌菌株進(jìn)行降膽固醇實(shí)驗(yàn)，通過比較這2種方法來選擇最宜的體外篩選的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

香豬源性雙歧桿菌，由實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 菌株名稱Table 1 The name of stains

1.1.2 主要設(shè)備及儀器

YQX-II厭氧培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW-CJ-10超凈工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司;CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡，奧林巴斯中國有限公司;TU—1810PC紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司;1260安捷倫高效液相色譜，安捷倫科技有限公司;08-2G磁力攪拌加熱冷凝回流裝置，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑

培養(yǎng)基:PTYG 培養(yǎng)基［13］，降膽固醇培養(yǎng)基CHOL-PTYG:參考陳路清［5］的方法進(jìn)行改良:在普通PTYG液體培養(yǎng)基中，加入膽固醇膠束溶解液使膽固醇濃度為0.1 mg/mL。1 000 mL液體培養(yǎng)基中含0.l mg/mL膽固醇膠束溶液的制備:準(zhǔn)確稱量膽固醇(分析純)0.1 g放入小燒杯中加入0.2 g牛膽鹽、1 mL TWEEN-80、0.1 g蔗糖八乙酸酯，攪拌均勻，再移取5 mL的冰乙酸加熱溶解，把溶解液用超聲波處理15 min后，過0.45 μm濾膜后快速加入到配制好的液體培養(yǎng)基中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液。以上均121℃滅菌20 min后備用。

主要試劑:膽固醇(≥99%)，色譜純，Sigma公司(C8667-1G);膽固醇(≥99%)，分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;鄰苯二甲醛 ，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蔗糖八乙酸酯 ，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

膽固醇儲(chǔ)備液(1 mg/mL):精確稱取0.05 g(精確至0.01 mg)膽固醇(色譜純)，用10 mL無水乙醇完全溶解后定溶至50 mL，即得1 mg/mL的膽固醇母液，于4℃冰箱放置過夜。

OPA試劑(0.5 mg/mL):精確稱取0.05 g鄰苯二甲醛，用20 mL冰乙酸完全溶解后定溶至100 mL，即得0.5 mg/mL的鄰苯二甲醛溶液，避光保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鄰苯二甲醛法(OPA)［14］

1.2.1.1 OPA法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取膽固醇儲(chǔ)備液各 0.2、0.5、1.0、1.2、1.5、2.0 mL，用無水乙醇定容至10 mL。配置分別相當(dāng)于 0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在各管中加入OPA試劑總體積達(dá)到4 mL，室溫放置10 min。再向其中緩慢加入4 mL濃硫酸，立即用振蕩器振20 s，充分混勻后于室溫條件下放置10 min。空白對照以1 mL無水乙醇代替膽固醇儲(chǔ)備液，最后測其在550 nm處的吸光度值，以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程。

1.2.1.2 總膽固醇提取

取待測液1 mL放于清潔試管中，每管加入6 mL的95%乙醇 ，混勻后每管加入4 mL的500 g/mL KOH溶液。然后加蓋置于60℃水浴鍋中水浴30 min進(jìn)行皂化，每隔10 min振搖1次使皂化完全，皂化完畢取出試管冷卻后加入10 mL正己烷，用振蕩器振1 min，使之充分混合，再加入6 mL蒸餾水，混勻。在室溫放置20 min，靜置分層，小心吸取8 mL正己烷層(上層)轉(zhuǎn)移到清潔試管中小心放置于60℃水浴鍋中，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.1.3 總膽固醇測定

于蒸干后的試管中加入4 mL當(dāng)天配置的OPA試劑，室溫放置10 min。再向其中緩慢加入4 mL濃硫酸，立即用振蕩器振20 s，充分混勻后于室溫條件下放置10 min。最后測其在550nm處的吸光度(A550)，以空白實(shí)驗(yàn)校零，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果用mg/mL表示。

1.2.2 高效液相色譜法［15］

1.2.2.1 樣品測定前處理

(1)皂化。加入20 mL的降膽固醇培養(yǎng)基上清液，于250 mL平底燒瓶中，用10 mL無水乙醇分3次沖洗三角錐形瓶，洗液并入平底燒瓶。再加入20 mL無水乙醇，10 mL 60%KOH溶液，混勻。將試樣在100℃磁力攪拌加熱皂化回流1 h，皂化結(jié)束，用10 mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部和溫度感應(yīng)器，取下平底燒瓶，冷卻至室溫。

(2)提取.向冷卻皂化液中加入5 mL蒸餾水，用漏斗全部轉(zhuǎn)移與250 mL分液漏斗中，用30 mL蒸餾水，分3次沖洗平底燒瓶和漏斗，洗液并入分液漏斗，再用40 mL正己烷分3次沖洗平底燒瓶和漏斗，洗液并入分液漏斗，振搖2 min，靜置分層。轉(zhuǎn)移水相于第二個(gè)分液漏斗，再用30 mL正己烷重復(fù)提取兩次，棄去水相，合并3次有機(jī)相。分別用10mL正己烷用蒸餾水每次100 mL洗滌提取液至中性(5次)，提取液通過約10 g無水Na2SO4脫水，全部轉(zhuǎn)移至250 mL平底燒瓶中，用20 mL正己烷分2次沖洗分液漏斗，一并倒入平底燒瓶。

(3)濃縮。將上述平底燒瓶中的提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，40～45℃蒸發(fā)至近干，用無水乙醇溶解定容至10 mL，超聲溶解，然后過0.45μm過濾膜，過濾液待HPLC檢測。

1.2.2.2 高效液相色譜法測定色譜條件

色譜柱:SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×150 mm 5 μm;柱溫:35℃;流動(dòng)相:甲醇;流速:1 mL/min;波長205 nm;進(jìn)樣量 10 μL。

1.2.2.3 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取膽固醇儲(chǔ)備液各 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用無水乙醇定容至 10 mL。配置分別相當(dāng)于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL 質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后進(jìn)行HPLC測定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積(響應(yīng)值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程。

1.2.3 精密度試驗(yàn)

取同一空白CHOL-PTYG培養(yǎng)基溶液按方法1.2.1和1.2.2中的測定條件重復(fù)平行測定5次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，并分析其重現(xiàn)性。

1.2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取同一空白CHOL-PTYG培養(yǎng)基溶液按方法1.2.1和1.2.2中的測定條件重復(fù)平行測定3次，分別計(jì)算其膽固醇的濃度。另取CHOL-PTYG培養(yǎng)基溶液加入一定量的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照方法方法1.2.1和1.2.2分別計(jì)算兩種方法的加標(biāo)回收率。

1.2.5 雙歧桿菌降膽固醇率的測定

將表1中的5株菌株進(jìn)行活化，在PTYG培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)3次后，接種到液體PYTG培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。將待測菌液值調(diào)至OD 0.4按10%(V/V)接種量接種于膽固醇含量為0.1 mg/mL的CHOLPTYG 中厭氧培養(yǎng)(N2∶CO2∶H2=90∶5∶5)37 ℃中培養(yǎng)48 h。菌液以10 000 r/min，4℃條件下離心20 min，保留上層清液作為待測液用于測定膽固醇含量，以未接種的PTYG-CHOL作為對照。降膽固醇率S計(jì)算:

式中:S，降膽固醇率;B，未接種的PTYG-CHOL培養(yǎng)基中膽固醇濃度，mg/mL;A，待測發(fā)酵上清液中膽固醇質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)運(yùn)用OriginPro 8.0與SPSS Statistics 17進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPA法膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按方法1.2.2.1繪制的OPA法膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。膽固醇在0～0.20 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=4.9264x-0.0130，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 2。

2.2 HPLC法膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 膽固醇標(biāo)品的OPA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of cholesterol measured by OPA

從圖2可以看出，在1.2.3.2色譜條件下，膽固醇能夠很好地達(dá)到分離效果，其保留時(shí)間t(膽固醇)=6.852 min。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品分析顯示，保留時(shí)間在±0.1 s范圍內(nèi)均代表同一物質(zhì)。

圖2 膽固醇標(biāo)品的HPLC分離圖Fig.2 Chromatogram of standard solution of cholesterol

按方法1.2.3.3繪制的HPLC法膽固醇標(biāo)曲曲線見圖3，由圖3可以表明膽固醇濃度在0～0.70 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5 050.238 1x+32.166 7相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

圖3 膽固醇標(biāo)品的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve of cholesterol measured by HPLC

2.3 精密度試驗(yàn)

同一空白CHOL-PTYG培養(yǎng)基，相同條件下用OPA法重復(fù)測定吸光度5次，計(jì)算所得吸光度平均值0.493，相對平均偏差RSD%=0.32%(n=5)，表明OPA法重現(xiàn)性良好，儀器精密度良好。相同條件下用HPLC法重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算所得峰面積平均值1 074，相對平均偏差 RSD%=0.96%(n=5)，表明HPLC法重現(xiàn)性良好，高效液相色譜精密度良好。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

經(jīng)計(jì)算得到CHOL-PTYG培養(yǎng)基的膽固醇含量為0.103 mg/mL，加入質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)OPA方法測定其平均加標(biāo)回收率為100.18%，相對平均偏差RSD=0.30%(n=3)，說明OPA方法準(zhǔn)確可信。經(jīng)HPLC方法測定其平均加標(biāo)回收率為99.33%，相對平均偏差RSD=0.30%(n=3)。

2.5 實(shí)驗(yàn)菌株OPA與HPLC方法比較結(jié)果

將表2得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，得到t=0.437，查對t值表得出，OPA法與HPLC方法兩種方法的測定結(jié)果差異不顯著(P=0.669＞0.05)。5株菌株的降膽固醇率在12.34%～28.57%不等。

表2 5株雙歧桿菌菌株的降膽固醇率結(jié)果Table 2 The result of degradation rate of cholestrol of five strains in vitro

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鄰苯二甲醛法與高效液相色譜法檢測膽固醇含量這兩種方法，其精密度相當(dāng)，重復(fù)性好，所測得的加標(biāo)回收率表明兩種方法準(zhǔn)確可信。而且5株菌株經(jīng)過降膽固醇實(shí)驗(yàn)說明OPA法與HPLC方法兩種方法的測定結(jié)果差異不顯著(P=0.669＞0.05)，也即化學(xué)法OPA法與色譜法HPLC法均可用于降膽固醇雙歧桿菌的初篩檢測。郭翔［16］同樣通過OPA法與HPLC法測定卵磷脂-膽固醇膠束溶液中的膽固醇含量發(fā)現(xiàn)兩種方法其差異不顯著。

國標(biāo)GB/T5009.128《食品中膽固醇的測定》［6］中的同樣采用化學(xué)方法，但其試用范圍僅為各類動(dòng)物性食品中的膽固醇的測定，在測定時(shí)預(yù)先采用索氏脂肪提取法提取油脂后，再以硫酸鐵銨作為顯色劑，測定油脂中的膽固醇含量。而OPA是一種經(jīng)典的方法，所需的實(shí)驗(yàn)儀器及試劑條件更易獲取，不需要流動(dòng)相，測試環(huán)節(jié)中的成本相對較低，也無需在測定膽固醇實(shí)驗(yàn)之前，先提取脂肪，縮短了試驗(yàn)進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)的高效液相方法是在國標(biāo)GB/T22220-2008《食品中膽固醇的測定》［15］基礎(chǔ)上修改了提取步驟的試劑，用正己烷代替了石油醚和乙醚，發(fā)現(xiàn)提取效果良好，避免了由于乙醚揮發(fā)性大而造成的溶劑損失。筆者在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，OPA法相對于HPLC法而言，具有檢測迅速，可在2 h內(nèi)完成的特點(diǎn)，且在待測液膽固醇的提取步驟中更為簡便。而HPLC法在皂化提取步驟中較繁瑣，更容易因?yàn)槿藶椴僮鞑划?dāng)，造成人為誤差。有報(bào)道可以通過不進(jìn)行皂化處理而直接用石油醚、氯仿、甲醇萃取［17-18］或者是通氮?dú)饧涌煸砘幚恚?9］等方法測定膽固醇，效果良好，所以后期也將繼續(xù)對本試驗(yàn)中方法進(jìn)行改良，在篩選的后期階段采用高效液相方法來驗(yàn)證OPA法的結(jié)果。所以，目前對于降膽固醇雙歧桿菌的前期大量的篩選環(huán)節(jié)，建議使用OPA法進(jìn)行對雙歧桿菌降膽固醇能力的測定。

另外本次試驗(yàn)的5株雙歧桿菌菌株的降膽固醇率在12.34% ～28.57%之間，降膽固醇能力不高。而香衛(wèi)欽［20］等從成年人的糞便中分離出1株雙歧桿菌，膽固醇去除率能達(dá)到34.6%，尹軍霞［25］等從東北虎的腸道篩選到1株兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)體外降膽固醇能力達(dá)到57.14%，后期還需繼續(xù)對高降膽固醇的雙歧桿菌進(jìn)行篩選或者對現(xiàn)有雙歧桿菌進(jìn)行誘變，以便得到1株高降膽固醇率的雙歧桿菌。

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