基于電子鼻的中式發(fā)酵香腸理化品質(zhì)指標(biāo)檢測方法*

張胡彬，何健葉，王志耕，梅林，薛秀恒

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽農(nóng)產(chǎn)品加工工程實驗室，安徽合肥，230036)

香腸后熟發(fā)酵過程中，反應(yīng)蛋白質(zhì)分解程度的“揮發(fā)性鹽基氮”(TVB-N)和脂肪氧化程度的“過氧化值”(POV)是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵理化指標(biāo)。但是，這兩項理化指標(biāo)的檢測存在樣品前處理較復(fù)雜、分析操作要求較高、耗時較長等不足，不能滿足生產(chǎn)企業(yè)對大批產(chǎn)品快速檢測的需求。探索一種簡單、便捷、無損的檢測方法具有實際應(yīng)用意義。

電子鼻是一種由具有部分選擇性的化學(xué)傳感器陣列和適當(dāng)?shù)哪Ｊ阶R別系統(tǒng)組成的能識別簡單或復(fù)雜氣味的儀器［1］。相比傳統(tǒng)的檢測手段，電子鼻技術(shù)表現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢:前處理方便、無損檢測、操作簡單、靈敏度高、結(jié)果客觀［2］，而且還能通過化學(xué)計量統(tǒng)計的方式進(jìn)行定量分析［3］。自1990年代興起以來，國內(nèi)外對電子鼻相關(guān)技術(shù)的研究一直十分活躍。在食品行業(yè)中，利用電子鼻檢測果蔬成熟度、評價肉類新鮮度、識別香精香氣成分、審評產(chǎn)品等級已有系列研究報道［4-10］，運用電子鼻研究不同后熟時期香腸的特征氣味指紋與理化品質(zhì)指標(biāo)(TVB-N、POV)的相關(guān)性，并通過氣味指紋識別模型對生產(chǎn)中的產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行快速檢測尚未見報道。

本試驗通過使用德國Airsense PEN3型電子鼻研究香腸在后熟發(fā)酵工藝過程中的風(fēng)味變化，并通過統(tǒng)計分析的方法建立香腸風(fēng)味變化與TVB-N和POV這兩個理化品質(zhì)指標(biāo)變化的聯(lián)系，并在此基礎(chǔ)上建立氣味指紋識別預(yù)測模型，以達(dá)到通過嗅探香腸氣味指紋快速檢測確定香腸TVB-N和POV值的目的。

1 材料與方法

1.1 原料

冷鮮肉，購自合肥市清溪路大潤發(fā)超市;膠原蛋白腸衣，保定，唯新腸衣有限公司;其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3型電子鼻(配Winmuster1.6.2氣味指紋分析處理軟件)，德國Airsense公司;恒溫恒濕箱，合肥華德利公司;R-3絞肉機，蘇州正元精密機械公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香腸制作工藝

將冷鮮肉分為肥肉和瘦肉兩部分，肥肉放入-4℃冰箱，冷凍2 h。使用篩板孔徑為1 cm的絞肉機將瘦肉及冷凍過的肥肉絞成肉丁。按肥瘦比3∶7混合，同時按20 mL/kg的比例加入白酒。按照配方(表1)加入其他各種配料。混勻并靜置2 h后，用灌腸機灌入膠原蛋白腸衣［11-12］。香腸懸掛于15℃，RH=40%的恒溫恒濕箱中后熟發(fā)酵，待電子鼻檢測。

1.3.2 氣味指紋的采集

在香腸后熟發(fā)酵工藝過程中的第 0、2、6、11、15天，分別取樣，使用電子鼻進(jìn)行氣味指紋采集。電子鼻工作條件設(shè)置為:傳感器清洗時間120 s、傳感器歸零時間 10 s、樣品準(zhǔn)備時間 5 s、進(jìn)樣時間 90 s、進(jìn)樣 流量 300 mL/min［9］。

表1 香腸配方表Table 1 Formula of Chinese sausage

1.3.3 檢測樣處理

取待測香腸樣品，剪碎成約0.5 cm3的小塊，每個樣取10 g，分裝于規(guī)定體積的頂空進(jìn)樣瓶中(除頂空體積實驗組外頂空瓶體積均為100 mL)，5個平行樣分為一組。置于規(guī)定溫度條件下(除溫度試驗組外均為15℃)，經(jīng)過規(guī)定時間富集后(除富集時間試驗組外均為15 min)進(jìn)行電子鼻檢測，取進(jìn)樣的第55～60秒(取樣時間試驗組除外)的氣味指紋數(shù)據(jù)作為有效數(shù)據(jù)。

1.3.4 試驗設(shè)計

(1)進(jìn)樣溫度:進(jìn)樣溫度分為-5℃(冰箱)、15℃(常溫)、35℃(水浴)、55℃(水浴)4組采集氣味指紋數(shù)據(jù)。

(2)頂空生成體積:采用100、250、500 mL的頂空進(jìn)樣瓶采集氣味指紋數(shù)據(jù)。

(3)氣體富集時間:氣體分別富集15、30、60 min后采集氣味指紋數(shù)據(jù)。

(4)取樣時間:取進(jìn)樣的第30～35 s、55～60 s、80～85 s分別采集氣味指紋數(shù)據(jù)。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定

在香腸后熟工藝過程中的第0、2、6、11、15 天，分別取樣，按GB/T5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中微量擴散法對樣品中的TVB-N值進(jìn)行測定，結(jié)果以每100 g香腸中所含氮的質(zhì)量(g)表示。

1.3.6 過氧化值(POV)的測定

在香腸后熟工藝過程中的第0、2、6、11、15 天，分別取樣，按GB/T5538-2005《動植物油脂過氧化值測定》所述方法對樣品中的POV值進(jìn)行測定，結(jié)果以每1 000 g香腸中活性氧的毫克當(dāng)量數(shù)表示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)，采用Spss18.0軟件進(jìn)行方差和回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 香腸在發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

2.1.1 TVB-N值的變化

試驗期內(nèi)，TVB-N值變化參見圖1。

圖1 香腸在發(fā)酵過程中TVB-N值變化趨勢Fig.1 TVB-N change trend of Chinese sausage during fermentation

由圖1可知，香腸在發(fā)酵過程中，隨發(fā)酵時間的增加，TVB-N值呈逐漸上升趨勢。前6天上升趨勢較快，而6 d之后上升趨勢開始減緩。這可能是由于發(fā)酵前期香腸中的水分含量較高，微生物活動較為活躍，引起TVB-N值的快速上升，而隨著干燥脫水，微生物活動受抑制，TVB-N值上升開始趨緩。

2.1.2 POV值的變化

試驗期內(nèi)，香腸的POV值變化參見圖2。

圖2 香腸在發(fā)酵過程中POV值的變化趨勢Fig.2 Peroxide vale change trend of Chinese sausage during fermentation

從圖2中可以看出，在香腸發(fā)酵的前6天，POV值基本不變，從第6天開始，POV值上升較快。表明，在試驗條件下，第6天開始，脂肪成分開始被氧化分解，引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生過氧化自由基。

2.2 氣味指紋識別模型建立

2.2.1 電子鼻傳感器陣列對香腸氣味的響應(yīng)

PEN3電子鼻有一個具有10個金屬氧化物傳感器的陣列系統(tǒng)，其中的每一個傳感器都會對所通過陣列的氣體中某一類物質(zhì)產(chǎn)生特征響應(yīng)。該響應(yīng)值用樣品氣的電導(dǎo)率(G)與背景空氣的電導(dǎo)率(G0)之比(G/G0或G0/G)來表示。將10個傳感器的電導(dǎo)率之比(G/G0或G0/G)集合起來就形成了該種物質(zhì)特征性的氣味指紋［5］。圖3為在香腸發(fā)酵過程中的第0、2、6、11、15 天傳感器陣列響應(yīng)圖。圖中每一條線分別代表一個傳感器的電導(dǎo)率之比G/G0(G0/G)隨進(jìn)樣時間變化趨勢。由圖中可以看出隨著發(fā)酵時間的變化，香腸氣味指紋圖譜發(fā)生了顯著的變化，說明電子鼻可以有效地識別不同發(fā)酵時期的香腸產(chǎn)品。同時各傳感器響應(yīng)值存在一定差異，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行差異度漸漸縮小。

圖3 PEN3電子鼻傳感器陣列對發(fā)酵天數(shù)的香腸氣味的響應(yīng)圖Fig3 Response of PEN3 electronic nose sensor array to smell of Chinese sausage in different fermentation time

2.2.2 電子鼻進(jìn)樣條件的優(yōu)化

在用電子鼻測量香腸氣味時，進(jìn)樣樣品溫度、樣品的頂空體積、樣品的富集時間以及氣味指紋數(shù)據(jù)的采集時間這些因素對采集的氣味指紋產(chǎn)生影響，降低所建立模型的區(qū)分度和識別能力，增加了系統(tǒng)誤差。

2.2.2.1 進(jìn)樣溫度的優(yōu)化

使用方差分析法，分析不同進(jìn)樣溫度(-5℃、15℃、35℃、55℃)對電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響，方差分析結(jié)果參見表2。表2中10根傳感器的P值全部小于0.001，說明進(jìn)樣溫度不同對所有傳感器的響應(yīng)值都有極顯著的影響，故有必要對進(jìn)樣溫度進(jìn)行優(yōu)化。

分析比較不同進(jìn)樣溫度條件下，電子鼻傳感器陣列對不同發(fā)酵天數(shù)(第 0、2、6、11、15 天)的香腸氣味的區(qū)分能力。分析結(jié)果參見表3，發(fā)酵第0、2、6、11、15天香腸的風(fēng)味具有極顯著的差異，觀察F值，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣溫度在35℃的時候具有最大的F值，說明在進(jìn)樣溫度為35℃時，樣品組間離差最大，組內(nèi)離差最小。說明進(jìn)樣溫度為35℃時電子鼻傳感器陣列對發(fā)酵天數(shù)不同的香腸的區(qū)分能力達(dá)到最高，故選定35℃為電子鼻進(jìn)樣溫度。

表2 各傳感器響應(yīng)值受進(jìn)樣溫度影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 2 Variance analysis of each sensor response value changing affected by the sample temperature

表3 采用不同進(jìn)樣溫度時傳感器陣列對不同發(fā)酵天數(shù)香腸氣味區(qū)分能力的比較Table 3 The comparison of separating capacity of sensors array to the smell of different fermentation time under different sampling temperature

2.2.2.2 樣品頂空體積的優(yōu)化

使用方差分析法，分析不同頂空生成體積(100、250、500 mL)對電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響，方差分析結(jié)果參見表4。表4中僅S6傳感器響應(yīng)值受頂空體積變化影響顯著，S6傳感器主要對CH4敏感，考慮到CH4在香腸香氣中含量較低，可以忽略S6傳感器對整體結(jié)果的影響。而其余各傳感器的P值均大于0.05。說明不同頂空體積組的組內(nèi)差異較大，而組間差異較小，頂空體積的變化對傳感器陣列總響應(yīng)值的影響不顯著。為進(jìn)樣方便，選取100 mL頂空體積瓶為測量瓶。

表4 各傳感器響應(yīng)值受進(jìn)樣頂空體積影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 4 Variance analysis of each sensor response value changing affected by headspace volume

2.2.2.3 樣品富集時間的優(yōu)化

使用方差分析法，分析不同樣品富集時間(15 min、30 min、60 min)對電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響，方差分析結(jié)果參見表5。

表5 各傳感器響應(yīng)值受樣品富集時間影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 5 Variance analysis of each sensor response value changing affected by accumulation time

表5 結(jié)果表明，1，2，3，5，6，7，9 號共 7 根傳感器的P值小于0.05，說明樣品富集時間對傳感器陣列中大多數(shù)傳感器的響應(yīng)值均可產(chǎn)生顯著影響，故有必要對樣品富集時間進(jìn)行優(yōu)化。

分析比較不同樣品富集時間條件下，電子鼻傳感器陣列對不同發(fā)酵天數(shù)(第0、2、6、11、15天)的香腸氣味的區(qū)分能力，結(jié)果參見表6。觀察F值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品富集時間為30 min時F最大，說明當(dāng)樣品富集時間為30 min時組間區(qū)分度最大，說明樣品富集時間為30 min時傳感器陣列對發(fā)酵天數(shù)不同的香腸的區(qū)分能力最高，故選定樣品的富集時間為30 min。

2.2.2.4 數(shù)據(jù)采集時間的確定

使用方差分析法，分析不同數(shù)據(jù)采集時間(30～35 s、55 ～60 s、80 ～85 s)對電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響，方差分析結(jié)果參見表7。發(fā)現(xiàn)除S4傳感器外，其他傳感器的P值全部大于0.05。由于S4傳感器主要對H2敏感，考慮到H2在香腸香氣中含量較低，故可以忽略S4傳感器對整體結(jié)果的影響。說明3組數(shù)據(jù)采集時間對氣味指紋數(shù)據(jù)的影響不顯著。觀察傳感器陣列響應(yīng)圖發(fā)現(xiàn)，本試驗中，傳感器響應(yīng)值從第50秒已經(jīng)開始趨于穩(wěn)定，為提高測試效率，故選擇55～60 s為氣味指紋采集時間。

表6 不同樣品富集時間條件下傳感器陣列對不同發(fā)酵天數(shù)香腸氣味區(qū)分能力的比較Table 6 The comparison of separating capacity of sensors array to the smell of different fermentation time under different accumulation time

2.2.3 氣味指紋識別模型的建立

利用的與PEN3電子鼻所配套的WinMuster1.6.2數(shù)據(jù)處理軟件，對使用上述優(yōu)化后的進(jìn)樣參數(shù)收集到的氣味指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。通過使用主成分分析(PCA)和線性判斷分析(LDA)，對用10個維度表示的香腸氣味指紋復(fù)合數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和轉(zhuǎn)換，最終擬合成“第一主成分”和“第二主成分”2個指標(biāo)表示的方式，并在二維散點圖上表示出來，分析結(jié)果如圖4和圖5所示。再通過偏最小二乘法(PLS)將氣味指紋數(shù)據(jù)和實際測量的指標(biāo)值擬合，最終形成一個記錄有香腸發(fā)酵不同時期氣味指紋和與之相對應(yīng)指標(biāo)值的識別模型，模型分析結(jié)果如圖6所示。

表7 各傳感器響應(yīng)值受數(shù)據(jù)采集時間影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 7 Variance analysis of each sensor response value changing affected by data-collection interval

圖5 不同發(fā)酵時間香腸氣味指紋的LDA分析Fig.5 LDA analysis of flavor finger-print of Chinese traditional sausage in different fermentation time

從圖4 PCA分析圖中可以看出，在主成分分析(PCA)中，第一主成分(PC1，橫坐標(biāo))和第二主成分(PC2，縱坐標(biāo))的區(qū)分貢獻(xiàn)率分別達(dá)到92.91%和5.01%，兩者合計達(dá)到97.92%，即可以用 PC1和PC2解釋的氣味差異達(dá)到97.92%，大于90%。說明完全可以用PC1和PC2來代表香腸的香氣差異。由圖還可知，0～11 d期間各組的區(qū)分度均大于0.900，氣味指紋數(shù)據(jù)區(qū)分良好。但第11天和第15天2組的區(qū)分度顯著降低，表明，香腸發(fā)酵前期，是風(fēng)味形成，香氣成分變化較大階段，而第11天后，香腸進(jìn)入發(fā)酵后期，特征風(fēng)味基本形成，香腸香氣的主體成分趨于穩(wěn)定。

圖6 不同發(fā)酵時間香腸氣味指紋的PLS模型分析Fig.6 PLS Model analysis of flavor finger-print of Chinese traditional sausage in different fermentation time

從圖5中可以看出，線性判別式函數(shù)LD1和LD2的貢獻(xiàn)率分別為86.93%和10.39%，兩者合計達(dá)到97.32%，大于90%，說明判別函數(shù)LD1和LD2可以較好地區(qū)分氣味指紋差異。

相比PCA分析，LDA分析的各組間的區(qū)分度明顯提高，可以更有效地區(qū)分不同后熟天數(shù)的香腸。這是因為在LDA分析中所構(gòu)造的判別函數(shù)是由原始變量經(jīng)線性組合能夠最大限度區(qū)分不同的樣本集，在降低數(shù)據(jù)空間維數(shù)的同時，也最大限度地減少了信息丟失。觀察發(fā)現(xiàn)，在整個后熟過程中，第一主成分的增長和后熟天數(shù)的增長成正相關(guān)趨勢。說明后熟天數(shù)的變化和氣味指紋的變化存在相關(guān)性。

圖6是用偏最小二乘法建立的PLS預(yù)測模型分析圖，可以觀察到各觀測日的氣味指紋數(shù)據(jù)區(qū)分度良好，差異主要表現(xiàn)在第一主成分(PC1)上，并隨著天數(shù)的增加成明顯的線性增長趨勢。PC1的區(qū)分貢獻(xiàn)率達(dá)到 97.29%，PC2的貢獻(xiàn)率為 2.29%，合計99.583%。說明在香腸后熟過程中，第一主成分的變化與后熟天數(shù)具有相關(guān)性。通過測量后熟發(fā)酵過程香腸的氣味指紋，并代入該模型分析，PLS預(yù)測模型就可以根據(jù)其香氣第一主成分與后熟天數(shù)的相關(guān)性，給出對后熟天數(shù)的判定。再將實測各天的TVB-N值和POV值指標(biāo)數(shù)據(jù)賦值給各天的PLS氣味指紋模型，這樣就可以達(dá)到利用PLS模型快速檢測指標(biāo)值變化的目的。

2.3 氣味指紋識別模型對訓(xùn)練和模擬測試

選取與建立識別模型同批次香腸樣品，分別選取第0，2，6，11，15 觀測日樣品的氣味指紋各5 個，共25個，組成氣味指紋預(yù)測模型的訓(xùn)練集。將訓(xùn)練集中的氣味指紋代入識別模型，記錄PLS模型給出的TVBN和POV的預(yù)測值，并與實際值進(jìn)行比較，計算預(yù)測誤差，結(jié)果如表8、表9所示。發(fā)現(xiàn)PLS預(yù)測模型對TVB-N值的預(yù)測較為精確，平均相對誤差僅為2.14%，而對POV的預(yù)測偏差稍大，平均相對誤差達(dá)到8.99%。用二維散點圖表示預(yù)測值與實測值之間的關(guān)系，通過線性擬合，訓(xùn)練集的預(yù)測值和實測值具有很好的線性相關(guān)性，TVB-N值和POV值的R2分別為0.994 2和0.991 1，擬合度良好(圖7、圖8)。說明使用所構(gòu)建的PLS預(yù)測模型，可以對訓(xùn)練集中的香腸樣品的指標(biāo)值完成準(zhǔn)確的預(yù)測。將訓(xùn)練集中的氣味指紋數(shù)據(jù)按發(fā)酵天數(shù)并入PLS模型中，完成對模型的訓(xùn)練。

表8 訓(xùn)練集預(yù)測誤差分析表Table 8 Error analysis of training set

表9 測試集預(yù)測誤差分析表Table 9 Error analysis of test set

再取與建立模型所用香腸不同批次的香腸，在其發(fā)酵過程中任意取25個氣味指紋，作為模擬測試集。代入PLS預(yù)測模型，同時進(jìn)行化學(xué)測試，比較預(yù)測值和實測值的差異，計算測試誤差。結(jié)果如表9所示，PLS模型對TVB-N值和POV值預(yù)測的平均相對誤差為5.59%和11.96%，相比訓(xùn)練集誤差有所增大。對POV值預(yù)測的平均相對誤差超過10%，這可能是由于樣品該指標(biāo)值本身較小，受化學(xué)測試存在的系統(tǒng)誤差的影響較大，導(dǎo)致相對誤差增大。但其標(biāo)準(zhǔn)誤僅為0.003，說明該預(yù)測仍有實用意義(圖9、圖10)。

圖7 訓(xùn)練集TVB-N值Fig.7 TVBN of training set data

圖8 訓(xùn)練集POV值Fig.8 Peroxide vale of training set data

圖9 測試集TVB-N值Fig.9 TVBN of test set data

圖10 測試集POV值Fig.10 Peroxide vale of test set data

3 結(jié)論

PEN3電子鼻測試香腸樣品的最佳進(jìn)樣條件為:進(jìn)樣溫度35℃，富集時間30 min，頂空體積100 mL，采集時間為55～60 s。

收集香腸發(fā)酵過程中氣味指紋數(shù)據(jù)，經(jīng)過PCA及LDA分析，表明PEN3電子鼻的傳感器陣列可以有效地區(qū)分不同發(fā)酵時期的香腸樣品。并推測香腸氣味指紋的預(yù)測值變化與發(fā)酵過程中TVB-N值及POV值的變化存在顯著的相關(guān)關(guān)系(R2:0.994 2和0.991 1)。

通過建立基于PLS的氣味指紋預(yù)測模型，可實現(xiàn)對影響香腸品質(zhì)的理化指標(biāo)(TVB-N值及POV值)的快速預(yù)測。為生產(chǎn)中對香腸品質(zhì)的檢測和控制提供了一種便捷、快速的新方法。

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