1種細菌型豆豉自然發酵過程中生物胺的變化*

蘇悟，鄭小芬，徐睿烜，涂婷，蔣立文

1(湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙，410128)

2(食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙，410128)

3(湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南 長沙，410128)

豆豉是經微生物發酵制成的調味副食品，以香誘人、風味獨特而深受消費者的真愛。根據制曲發時參與的微生物種類可分為毛霉型、曲霉型、細菌型及脈胞菌型豆豉［1］。水豆豉主要是云、貴、山東一帶民間制作的家常豉，其微生物主要是枯草桿菌以及少量的微球菌乳酸菌，其工藝簡單，就是將黃豆蒸熟后直接裝在袋子或者攤放在稻草上自然發酵，發酵完成后直接拌食。水豆豉自然發酵過程中微生物以細菌為主，發酵過程中易產生生物胺。生物胺是一類含氮低分子質量化合物的總稱，按化學結構可分為脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺)、芳香族(酪胺、苯基乙胺)和雜環類(組胺、色胺)［3］。人體內積累較高數量的生物胺時就會產生毒性作用，其中生物胺中毒性最大的是組胺和酪胺［4］。

發酵食品中過量的生物胺會對機體健康造成不良的影響。YONGMEIL等［5］檢測了中國豆醬中的生物胺含量，豆醬中主要含有酪胺、組胺和亞精胺，不同發酵類型品種生物胺有差別，生物胺生成量與樣品中氨基酸態氮含量呈現正相關，由此可以看出，可利用的游離氨基酸是微生物代謝產生生物胺的必要條件之一。張建華等［6］檢測了納豆發酵過程中的生物胺，在發酵納豆樣品中檢測到亞精胺、精胺、腐胺、酪胺4種生物胺，其中亞精胺的含量占總生物胺的70%左右，與人體有直接毒性的生物胺—酪胺含量低于14 mg/kg，95%以上的生物胺都是對人體沒有直接毒性的多聚胺。TANG T等［7］檢測了腐乳中生物胺的含量，同時比較了微生物發酵腐乳與酶制腐乳中生物胺含量的差別。腐乳中主要含有色胺、腐胺、組胺和酪胺，其平均含量分別為39.0、34.6、18.2、21.7 mg/kg，β-苯乙胺、亞精胺和精胺含量較低。微生物發酵腐乳中生物胺總量(129.0 mg/kg)低于酶制腐乳(137.7 mg/kg)，腐乳中生物胺總量低于安全限量。

目前國內外對于毛霉型、曲霉型豆豉和以納豆為代表的細菌型豆豉的營養成分和發酵工藝都進行了較深入的研究［8-10］，但國內對自然發酵過程中生物胺的變化研究甚少。且目前國際上對食品中的生物胺沒有統一的標準，少數國家也只對于食品中的部分生物胺作出了含量限定，現有的各項法規都只對魚類及其制品中的組胺進行了限定，因此對于食品中生物胺毒性和檢測技術的基礎研究，和生物胺限量標準的準確評估工作都是具有實際意義的。農村中，許多農戶都是將黃豆在自然條件下發酵，直接拌料進行食用，本文以普通黃豆為原料，研究一定溫度、一定裝載量、不同發酵時間對細菌型豆豉自然發酵過程中生物胺及氨基酸態氮2個指標的影響及其相關性，為食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 原料

黃豆、生姜、大蒜、桂皮、八角購于湖南農業大學生鮮市場。

1.1.2 試劑

NaOH，中國醫藥集團上海化學試劑公司;鄰苯二甲酸氫鉀，湖南省株洲市化學工業研究所;甲醛，上海化學試劑廠;組胺鹽酸鹽(himstaminedihydrochloride)、β-苯乙胺(β-phenylethylamine)、酪胺鹽酸鹽(tyramine hydrochloride)、腐胺(putrescine)、尸胺(cadaverine)、5-羥色胺(serotonin)、精胺(spermidine)、亞精胺(spermine)、色胺鹽酸鹽(tryptaminehydmchloride)，Aldrich 公司;l，7 二氨基庚烷(1，7-diaminoheptane，內標)，Acros公司;苯甲胺鹽酸鹽(benzylamine hydrochloride，內標)、丹磺酰氯(dansylchloride)，Sigma公司;甲醇、丙酮，色譜純;乙醚(重蒸)、正丁醇、氯仿、HCl、三氯乙酸(TCA)、NaCl、NaHCO3、谷氨酸鈉(分析純)、超純水。

1.2 主要儀器設備

TE212-L電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司;HH-數顯恒溫水浴鍋，上海浦東物理化學儀器廠;pHS-25型數顯酸度計，中國雷磁儀器有限公司;HJ-1磁力加熱攪拌器，江蘇醫療儀器廠;DGG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森德實驗儀器有限公司;JJ-2組織搗碎勻漿機，上海浦東物理化學儀器廠;高效液相色譜儀HPLC配紫外檢測器或二極管陣列檢測器;離心機(4 000 r/min)，北京醫用離心機廠;旋渦混合器 ortex-2genie USA，seinetitic industries，INC，USA;氮氣濃縮器(N-EVAPORATOR)，OrganomationassociatesINC.USA;Waters高效液相色譜儀e2695配2489紫外檢測器，美國沃特斯有限公司;色譜柱 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，GL Sciences;超純水器B110-B，長沙源科儀實驗器材有限公司;微型旋渦混合儀WH-2，上海瀘西分析儀器廠有限公司;臺式低速離心機TG16，長沙英泰儀器有限公司;多用調速振蕩器 HY-4，江蘇金壇市醫療儀器廠;氮氣吹掃儀MD200，杭州奧盛儀器有限公司;電子分析天平AR2140，奧豪斯國際貿易(上海)有限公司;生化培養箱LRH-300，韶關市泰宏醫療器械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌型水豆豉制作工藝流程

黃豆→清選→加水浸泡→蒸煮(高壓121℃、15 min)→冷卻→前發酵(37℃、不同時間)→直接拌料→成品。

1.3.2 試驗方法設計

以下操作均為一致的黃豆浸泡條件:泡豆水pH 8.0，泡豆溫度常溫，豆量∶水量為1∶4(g∶mL)，泡豆時間10 h。高壓121℃、15 min蒸熟，降溫到45℃后，用1 kg的食品級包裝袋包裝發酵，平整后在包裝袋表面扎數個小孔，裝豆量800 g，發酵時間72～120 h，發酵溫度為37℃，稱取發酵樣品，按48、72、96、120 h不同發酵時間，測定氨基酸態氮和生物胺含量，每個試驗重復3次。

1.4 檢測方法

1.4.1 氨基酸態氮的測定［11］

1.4.2 生物胺含量的測定［12］

1.4.2.1 標準溶液的配制及標準曲線制作

各生物胺標準品用0.1 mol/L HCl溶液配制成質量濃度為1 mg/mL的儲備液(酪胺鹽酸鹽和二鹽酸組胺需折算掉鹽酸鹽)，分別吸取相同體積的8種生物胺單組分置于同一個容量瓶中，配制成100 mg/L的生物胺標準混合使用液。所有溶液均避光保存于4℃冰箱中。

將混合使用液配制成一定濃度的標準系列，標準系列的濃度為:2.50，5.00，10.00，15.00，25.00，50.00 mg/L。分別吸取0.5 mL生物胺標準系列溶液進行生物胺衍生化。為確定生物胺混合標準品的出峰順序，配制成40 mg/L的8種單一生物胺標準品，可由生物胺標準品圖譜的保留時間來確定每種生物胺。

1.4.2.2 生物胺的提取和衍生

生物胺的提取和衍生依據《GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測定》。準確稱取絞碎后的豆豉樣品10.00 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液，和2.0 mL(100 mg/L)內標使用液，混勻，振蕩提取60 min，轉至50 mL離心管中，3 600 r/min離心10 min，取上清液，置50 mL容量瓶中，連續提取2次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀釋至刻度，濾紙過濾。

將上述溶液加入適量HaCl至飽和，準確移取該飽和液5.00 mL，置于15 mL離心管中，用0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH至12.0，加入5.0 mL正丁醇-三氯甲烷混合液(1+1)，渦旋振蕩5 min，3 600 r/min離心10 min，取上層有機相，再重復萃取2次，最后一步萃取用分液漏斗分離，合并萃取液，混勻，取3.0 mL萃取液并加入0.2 mL 1 mol/L HCl，混合后40℃水浴下氮氣吹干，加入1.0 mL 1mol/L HCl使殘留物溶解，待衍生。

取經過提取，凈化、萃取后的樣液0.5 mL，置于10 mL具塞試管中，加入1.5 mL NaHCO3飽和溶液、1.0 m丹磺酰氯衍生溶液，振蕩使混勻。置60℃培養箱中反應30 min，中間振蕩2次，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉(50 mg/mL飽和 NaHCO3溶液)，振蕩混勻，60℃中保溫15 min。取出，每個試管中加入1 mL超純水，40℃水浴下用氮氣出去丙酮。加入3 mL乙醚，振蕩2 min，靜置分層后吸取出上層有機相(乙醚層)，重復萃取2次，合并乙醚萃取液，氮氣吹干，加入1.0 mL甲醇使殘留物溶解，振蕩混勻，0.22 μm濾膜針頭濾器過濾，濾液待測。

樣品衍生后，依據《GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測定》上機測定。為了使各種生物胺的保留時間縮短，而響應值高，分離度高，改變了色譜條件:將1.5 mL/min流速改為1.0 mL/min，梯度洗脫程序更改情況如表1所示。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program list

1.4.2.3 精密度的測定

取濃度為25.00 mg/L的混合標準溶液衍生樣品，平行進樣7次，根據測定結果計算相對標準偏差RSD。

1.4.3 對照樣品分析

樣品來源:購買3個不同品牌商品發酵豆豉測定其中8種生物胺的含量。

生物胺的提取:樣品經研磨充分后，取樣，用三氯乙酸提取，將試樣除脂肪、萃取進行凈化，然后進行生物胺的衍生反應，樣液待測。

1.4.4 數據處理

所有數據利用Excel表格進行分析。

2 結果與分析

2.1 標準樣品和實際樣品圖譜

40 mg/L單一生物胺衍生物的色譜圖如圖1、圖2所示。

更改了流速和梯度洗脫程序后，濃度為50 mg/L 8種生物胺標準溶液混標的色譜圖如圖3所示。

圖1 β-苯乙胺衍生物色譜圖Fig.1 Beta phenethylamine derivative chromatogram

圖2 酪胺衍生物色譜圖Fig.2 Tyramine derivative chromatogram

圖3 8種生物胺標準色譜圖Fig.3 Standard chromatogram of eight kinds of biogenic amine

從圖3可以看出，相較國標方法30min所有生物胺衍生物全部洗脫出來，整個梯度洗脫結束為45 min，更改流速和調整洗脫程序后28 min內所有生物胺衍生物被全部洗脫出來，洗脫程序結束時間為32 min，提前了13 min，節省了樣品分析時間，在實際檢驗分析工作中有很重要的意義，且各生物胺衍生物分離效果好，峰形對稱，無雜質干擾，因此該流動相梯度是可行的。8種單一生物胺衍生物分析結束后，確定混合標準溶液8種生物胺衍生物的出峰順序為:組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺、精胺。

2.2 實驗方法的驗證

以標準系列溶液的質量(μg)為縱坐標，以各種生物胺和內標的峰面積比為橫坐標，繪制標準曲線。8種生物胺的保留時間、回歸方程和相關系數見表2。

表2 8種生物胺的保留時間、回歸方程和相關系數Table 2 Retention time，the regression equation and correlation coefficient of 8 kinds of biogenic amine

檢測方法的驗證結果見表2。由表2可以看出，8種生物胺的含量在2.5～50 mg/L時，其回歸方程R2大于等于0.992 8，可以滿足生物胺檢測的需求。

2.3 精密度

8種生物胺精度度試驗結果見表3。

表3 精密度試驗結果Table 3 precision test results

2.4 前發酵過程中生物胺的變化

表4 生物胺含量測定結果(37℃)Table 4 Biogenic amine content determination results

上表為最適發酵條件下，選取不同時間梯度對豆豉中生物胺含量的測定結果，從發酵豆豉中共檢測到8種生物胺。所有樣品中均含有β-苯乙胺含量、尸胺、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺。不同樣品中生物胺種類及總量均有差異。由表4可知，發酵水豆豉中生物胺含量的顯著差異與原料裝載量、發酵或儲存時間有關。

提取上表中酪胺、尸胺、組胺的數據繪制成折線圖，與不同發酵時間氨基酸態氮含量進行比對，見圖4～圖7。

圖4 氨基酸態氮含量變化曲線Fig.4 The curves of amino acid nitrogen content

圖5 酪胺含量變化曲線Fig.5 The curves of tyramine content

從圖4～圖7可以發現，從發酵48h起，豆豉中氨基酸態氮含量存在著先大幅增加再緩慢下降的趨勢，由于是自然發酵，所以隨著時間延長細菌繁殖，可能有脫羧酶的微生物參加，而導致氨基酸態氮出現后期下降的現象。

圖6 尸胺含量變化曲線Fig.6 The curves of cadaverine content

圖7 組胺含量變化曲線Fig.7 The curves of histamine content

豆豉中酪胺的含量與氨基酸態氮的含量變化存在著一致性，這也從一定程度上反映了和驗證了之前關于氨基酸態氮是生物胺產生的條件之一的說法。發酵初期豆豉中的游離氨基酸含量越高，產生生物胺的可能性就越大。而尸胺含量在發酵72 h隨著氨基酸態氮含量的增加達到最高值，之后驟降到相對穩定的較低值。組胺含量從發酵48 h起逐漸上升，雖然沒有在含量上明顯表現出和氨基酸態氮的一致性，但是其含量的上升可能消耗了游離氨基酸而導致了氨基酸態氮后期的緩慢下降，因此細菌性豆豉自然發酵過程中要控制發酵時間，不然可能會因為組胺生成造成安全隱患。

2.5 對照材料中生物胺的含量

3個樣品中生物胺的含量測定結果如表5所示。

根據表5數據可知，所測定樣品中均未檢出精胺和亞精胺。臘八豆含有4種生物胺，但是含量較低;豆鼓的生物胺含量較低，種類少，油辣椒豆豉生物胺含量最少，僅含有少量的色胺。色胺能夠引起高血壓，然而許多國家都沒有對色胺制定限量標準［14］。

與自然發酵細菌性豆豉工藝比較，豆豉、臘八豆一般采用接種米曲霉或者毛霉發酵，加上均有油炸或炒制工藝和其他配料，這類產品中生物胺的含量較低。

表5 幾種發酵豆制品樣品中生物胺的含量Table 5 Biogenic amine content in several fermented soy products

3 結論

細菌型豆豉發酵過程中的發酵時間、裝載量以及發酵溫度對氨基酸態氮的含量有著直接的影響，而氨基酸態氮是生物胺生成的條件之一。豆豉發酵過程中產生的對人體危害較大的組胺和酪胺都與氨基酸態氮的含量有一定相關性，從發酵48 h起，豆豉中酪胺的含量與氨基酸態氮的含量都存在著先大幅增加再緩慢下降的趨勢。但是總體來說，細菌型豆豉發酵過程中的生物胺均在國家規定的最大范圍之內(組胺50～100 mg/kg，酪胺100～800 mg/kg)，理論上對人體不具有生理危害，但也應注意，由于組胺含量一直處于上升趨勢，細菌型豆豉自然發酵過程中要控制發酵時間，不然可能會因為組胺生成造成安全隱患，豆豉發酵過程中也應優化其發酵條件來抑制生物胺的生成，進一步降低其含量。

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