水蒸氣蒸餾法提取花椒精油及揮發性成分分析*

張懷予，王軍節，，陳園凡，魏晉梅，李貞子，方碩

1(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川，750021)2(西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州，730124)

3(甘肅農業大學研究測試中心，甘肅蘭州，730070)

花椒是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum L.)植物花椒的果皮，是常用的香辛料和重要的中藥，具有藥食兩用的價值［1］。花椒中含有大量的精油，是花椒香氣的主要來源。花椒精油不僅作為香料和調味品的基料，還因其具有殺蟲、驅蟲、抑菌及治病等特性而用于農藥、醫藥等行業，具有廣闊的綜合開發前景［2-4］。目前精油的提取、成分分析及應用已成為研究熱點［5-6］。精油提取的方法主要有水蒸氣蒸餾［7-8］、微波提取［9-10］、超聲波提取［11］、超臨界 CO2萃取［12］和亞臨界萃取［13］等，且不同方法［14］和不同資源［15］影響精油提取效率、化學組成及含量，同時工藝參數優化可顯著提高精油得率［16］。然而甘肅花椒提取精油的工藝、優化和化學組成則鮮有報道。本研究采用水蒸氣蒸餾法結合響應面設計對甘肅武都大紅袍花椒的精油提取工藝進行優化，并運用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)對精油進行分析和鑒定［17］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒為武都“大紅袍”品種，購自于甘肅蘭州永樂藥業有限公司。

9FZ-15B型多用粉碎機，四川簡陽市富強機械制造有限公司;水蒸氣蒸餾裝置;油水分離器;MH-500型可調式電熱套，HW型遠紅外干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;10 μL微量進樣針，上海安亭微量進樣器廠;YP202N型0.01 g感量電子天平、FA2204B感量0.000 1 g電子天平，上海精密科學儀器有限公司;70目金屬篩，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司;Agilent 6890 GC-5973 MSD氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司;OV1701 60 m×0.25 mm(i.d)×0.5 μm色譜柱，中科院蘭州化物所;干燥器;15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶，美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾花椒精油工藝流程

花椒→粉碎→過篩→稱量→裝料→蒸餾→精油

粉碎、過篩:將粉碎的花椒粉末經70目過篩，得到篩上物和篩下物。花椒的果實、籽、柄的部分所含精油的量不同，因此取用花椒粉末的質量以篩上物和篩下物1∶2的質量比值進行分配，以達到較均勻取樣，從而減少所帶來的誤差。

裝料:將稱好的20 g花椒粉末裝入2 L圓底燒瓶中，并加入數顆玻璃珠，調整料液比，浸泡12 h，之后放入可調式電熱套進行加熱，開啟冷凝管。

蒸餾:水蒸氣隨著沸騰進入冷凝管冷卻，隨后進入油水分離器，進行油水分離，精油浮上面，水在下面，當水開始下滴時，記錄時間，直到結束蒸餾，測量收集的水容積，即為蒸汽量。

精油:利用微量進樣器吸出精油低部的水珠，將上述精油，通過裝有Na2SO4的干燥器，將得到的純精油，稱重后轉入精油瓶，并保存在4℃備用。

1.2.2 水蒸氣蒸餾花椒精油的單因素實驗

選取料液比、蒸餾時間、蒸氣量3個因素進行單因素實驗，以精油得率為指標，確定各因素的優化區間。

料液比:在蒸餾時間、蒸氣量不變條件下，料液比值(g∶mL)為 0.04、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 時，對精油得率的影響，重復3次，取平均值。

蒸餾時間:在料液比、蒸氣量不變時，考察蒸餾時間分別為 30、60、90、120、150 min，對精油得率的影響，重復3次，取平均值。

蒸氣量:在料液比、蒸餾時間不變條件下，選取蒸氣量為20、45、70、95、120 mL 時，對精油得率的影響，重復3次，取平均值。

1.2.3 精油得率計算

1.2.4 水蒸氣蒸餾花椒精油響應面優化實驗

根據單因素實驗，選擇料液比值、蒸氣量、蒸餾時間3個因素為自變量，精油得率為響應值，進行中心組合設計(CCD)優化精油提取工藝，每個實驗重復3次，因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 花椒精油揮發性成分分析

氣相色譜條件:OV1701色譜柱(中等極性，30 m×0.25 mm ×0.25 μm);采用程序升溫，50℃保持 2 min，以5℃/min速率升至250℃，保持10 min，載氣為高純度He(99.99%)，柱前壓50 KPa;載氣流量1.0 mL/min;氣化室溫度為250℃，進樣量1 μL;分流比 1∶10。

質譜條件:EI離子源;溫度250℃;四極桿溫度100℃;電子能量70 eV;接口溫度280℃;電子倍增器電壓1.8 kV;質量掃描范圍30～500 m/z。

采用NIST譜庫檢索，采用峰面積歸一法確定化學成分及相對含量。

1.2.6 數據處理方法

采用Design-Expert 8.0.6設計軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 料液比值對精油得率的影響

由圖1可知，料液比值對精油得率的影響為雙峰型變化，呈先增大后減小的趨勢。料液比值在0.04、0.05時精油得率均較低;隨著比值增大得率顯著增加，在0.1時達到最高峰，然后得率呈下降趨勢，0.2時得率輕微上升，最后得率隨比值進一步增大而下降。因此，優化的料液比值確定為0.05、0.1、0.15。

圖1 料液比值對精油得率的影響Fig.1 Effect of the material-water ratio on extraction yield of essential oil

2.1.2 蒸汽量對精油得率的影響

在圖2中，精油得率隨著蒸汽量的增加，而表現出先上升后降低的趨勢。蒸汽量在70 mL時，達到最大值，之后隨著蒸汽量的增大，精油得率逐漸下降。故蒸汽量的優化取值確定為45 mL、70 mL、和95 mL。

圖2 蒸汽量對精油得率的影響Fig.2 Effect of the vapour volume on extraction yield of essential oil

2.1.3 蒸餾時間對精油得率的影響

從圖3中看出，蒸餾時間對精油得率的影響呈單峰型變化。隨著蒸餾時間的增加，得率逐漸上升，當時間90 min時，精油得率達到最高峰，而后隨著時間的延長，得率則不斷下降，到120～150 min時，得率變化極其微小。因此，蒸餾時間的優化取值為60、90和120 min。

2.2 響應面優化實驗結果與分析

2.2.1 中心組合設計結果與分析

圖3 蒸餾時間對精油得率的影響Fig.3 Effect of the distillation time on extraction yield of essential oil

以料液比值(A)、蒸氣量(B)、蒸餾時間(C)為自變量，以精油得率(Y)為響應值，中心組合設計實驗方案和結果見表2。

采用軟件Design-Expert 8.0.6對實驗結果進行二次多元回歸擬合和方差分析，得到精油得率對料液比值、蒸汽量及蒸餾時間的回歸方程為:

Y=6.56+0.46A+0.22B+0.23C+0.31AB-0.27AC-0.17BC-1.10A2-1.19B2-0.42C2

由方差分析表3可知，二次多項式模型 P＜0.000 1，失擬項P=0.310 2＞0.05，表明回歸方程擬合程度好，誤差小，該方程與實測值能較好的擬合;復相關系數R2=0.973 9，說明回歸方程對精油得率的預測值與實測值有較好的相關性;校正決定系數Adj R2=0.950 4，表明95.04%的實驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋;故可用該回歸方程對實驗結果進行分析和預測。同時可知，除了蒸汽量(B)和蒸餾時間(C)交互作用BC對精油得率影響不顯著(P＞0.05)外，料液比值(A)、A2、B2、C2對精油得率影響均極顯著(P ＜0.01)，B、C、AB、AC 對得率影響均顯著(P＜0.05)，各因素對精油得率的影響不是簡單的線性關系，而且影響精油得率的因素依次為料液比值＞蒸餾時間＞蒸汽量。

表2 中心組合實驗設計及結果Table 2 CCD matrix and corresponding results

2.2.2 響應面曲線圖分析

根據回歸方程，得到各因素交互作用對精油得率影響的響應面圖和等高線圖(圖4)，其中等高線圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓表示兩交互作用顯著［20］。由圖4-a可知，蒸餾時間一定時，隨著料液比值與蒸氣量增加，精油得率呈先升高后下降的趨勢。當料液比值在0.09～0.11，蒸汽量在65～75 mL時，精油得率可達到最大值6.8%。其中，料液比值對精油得率的影響大于蒸汽量。圖中等高線圖為橢圓形，表明料液比值和蒸汽量兩因素的交互作用顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the developed regression model

圖4 各兩因素交互作用對精油得率影響的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of three factors on extraction yield of essential oil

由圖4-b可知，在蒸汽量不變時，料液比值對精油得率的影響為先增大后減小，蒸餾時間對精油得率的影響則為先上升后趨于平穩趨勢。料液比值對精油得率的影響大于蒸餾時間。當料液比值在0.09～0.11，蒸餾時間在85～95 min時，得率有最大值。等高線圖為橢圓形，說明料液比值和蒸餾時間兩因素交互作用顯著。

從圖4-c可以看出，蒸汽量對精油得率的影響呈快速升高后逐漸下降的趨勢，蒸餾時間對精油得率的影響則呈先上升后趨于平穩趨勢。圖4-c中蒸汽量對精油得率的影響大于蒸餾時間，且結合表3可知，等高線圖接近圓形，在一定范圍內兩因素交互作用不顯著。

2.2.3 驗證實驗

通過對回歸方程求一階偏導，得到水蒸汽蒸餾花椒精油工藝中料液比值、蒸汽量、蒸餾時間的最佳組合，最佳組合為:料液比值0.11、蒸汽量72.61 mL、蒸餾時間95.61 min，此條件下精油得率的預測值為6.64%。為了驗證模型的準確性，將水蒸汽蒸餾花椒精油的最佳工藝條件修正為:料液比值0.11、蒸汽量73 mL、蒸餾時間96 min，并進行3次驗證實驗，得出精油得率為6.71%，與理論預測值較為接近，說明模型的擬合程度較好，回歸方程對水蒸汽蒸餾花椒精油工藝進行分析和預測可靠，可以利用該工藝條件制備花椒精油。

2.3 花椒精油揮發性成分分析

采用GC-MS對本實驗所得的花椒精油進行分析，GC-MS所得總離子流圖見圖5，通過對總離子流圖的各峰進行質譜掃描后得到質譜圖，經過計算機質譜譜庫檢索(選擇匹配度大于80%的結果)，結合保留時間，最終確定出花椒精油中的化學成分，并用面積歸一法計算各化學成分相對含量。

圖5 花椒精油揮發性成分的總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion current chromatogram of essential oil

由表4所示，花椒精油中共檢測出73種化學成分，經鑒定的31種，占揮發油總量的95.16%，其中包括萜烯16種(39.93%)，醇 7種(29.65%)，酯 5種(22.84%)，醚1種(0.27%)，酮 1 種(2.32%)，烴 1種(0.15%)，并以萜烯、醇和酯類物質為主。這31種成分中，檸檬烯(20.204%，檸檬香、柑橘香、甜香)和芳樟醇(16.645%，玫瑰的花香、木香、果香)［17］，鄰氨基苯甲酸芳樟酯(19.733%，甜橙的香氣)的含量較高，占揮發油總量的56.58%，是構成甘肅大紅袍花椒精油的主要成分，特別是鄰氨基苯甲酸芳樟酯在以往花椒揮發油文獻中，含量在2% ～6%［19-20］，而本實驗中的差異可能是花椒產地不同所致。

表4 花椒精油主要揮發性成分分析結果Table 4 GC-MS analysis results of main volatiles in essential oil

續表4

3 結論

以甘肅武都大紅袍花椒為原料，根據單因素及響應面中心組合設計實驗，得到水蒸汽蒸餾法提取花椒精油的最佳工藝:料液比值0.11(g∶mL)、蒸汽量73 mL、蒸餾時間96 min，在該條件下實際精油得率為6.71%，與理論預測精油得率6.64%較為接近，可用該工藝進行花椒精油的生產。

經GC-MS對所制備的花椒精油進行分析，精油中共檢測出73種化學成分，鑒定出其中31種，占揮發油總量的95.16%，并以萜烯、醇和酯類物質為主。檸檬烯、芳樟醇和鄰氨基苯甲酸芳樟酯為當地花椒精油主要成分，含量分別達到20.204%、16.645%和19.733%。無論提取方法、花椒品種和產地不同，前人研究結果均表明檸檬烯和芳樟醇為花椒精油的主要成分［3，8，11，14-16］。檸檬烯具有抗腫瘤、抑菌、止咳、祛痰、平喘、溶解膽結石等功效［21-22］，而芳樟醇具有抑菌、抗腫瘤和鎮痛等作用［21-26］，因此，所提取花椒精油的藥用價值極高，是一種集營養、美味與保健于一體的植物精油［27］。本研究首次發現提取花椒精油中含有高含量鄰氨基苯甲酸芳樟酯，該成分的天然存在報道少見［28-30］，因此推測其來源可能是甘肅產花椒特有或提取過程中生成。鄰氨基苯甲酸芳樟酯具有類似甜橙水果香味［29］，但其在所提花椒精油中呈香作用尚不明確。因此，有關鄰氨基苯甲酸芳樟酯在該花椒精油中的來源、呈香貢獻和生物活性均有待進一步研究。

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