采用SPE-HPLC測定啤酒中15種酚酸化合物

王莉娜，胡雪蓮

1(北京燕京啤酒集團公司技術中心，北京，101300)

2(燕京啤酒啤集團酒釀造技術北京市重點實驗室，北京，101300)

酚酸類化合物廣泛分布于各種植物體中，它是植物體重要的次生代謝產物。酚酸類化合物中的酚羥基是優良的氫給予體，對過氧自由基(·OOH)、羥基自由基(·OH)等具有明顯的清除作用。由此，植物中的酚酸類化合物成為一種非常優良的天然抗氧化劑。有研究表明，酚酸對人體具有抗氧化、抗自由基、抗炎、抗癌等一系列保健藥效功能。啤酒是以麥芽和啤酒花為釀造原料的低酒精類飲料，其中含有較豐富的酚酸類物質。眾所周知，啤酒一經灌裝，即開始了風味逐漸惡化的過程，隨著儲存時間的延長，啤酒會逐漸出現令人不愉快的氧化味，目前國際上對氧化味的形成已基本達成共識:認為啤酒氧化味形成主要有6種途徑，包括啤酒中類黑精、不飽和脂肪酸等物質的自氧化過程等。酚酸作為一類具有抗氧化功效的物質，能夠延緩，甚至阻止氧化過程的發生［1-3］。因此對啤酒中酚酸類物質進行準確測定在啤酒風味穩定性的研究中具有十分重要的意義。

對于酚酸的測定，已報道的分析方法主要有液相色譜法、液相色譜-質譜法、毛細管電泳法等，高效液相色譜法是目前較為常用的酚酸分析方法。但由于啤酒中酚酸含量較低，啤酒基體又十分復雜，因此準確測定啤酒中酚酸的含量是一項十分困難的工作。通常需先行對啤酒中的酚酸進行分離、富集等處理后，方可用于儀器分析。溶劑萃取濃縮是早年曾用的技術，劉群濤等采用乙酸乙酯萃取測定了啤酒的10種酚酸，但該法操作繁瑣，溶劑耗量大，檢測的靈敏度低［5］。比較而言，固相萃取是近年所用的更簡捷有效的樣品前處理技術。2004年，García等人在無醇啤酒的酚酸分析中，采用Waters Sep Pak C18固相萃取柱作樣品的萃取凈化，測定了啤酒中10種酚酸組分，但該方法測定結果中大部分酚酸組分回收率較低，并且公認對啤酒抗氧化能力具有重要作用的沒食子酸的回收率僅6%，且未在實際樣品檢測中均未能檢出［4］。2007年，DVOˇRáKOVá等人對6種固相萃取小柱的萃取凈化效果進行了較為詳細的研究，指出不同類型的固相萃取柱對啤酒中酚酸檢測的回收率和精密度有較大影響［6］。本研究采用SPE-HPLC方法，在研究比較了，并優化了SPE柱的種類、淋洗操作及樣品pH等諸多條件后，著力解決了沒食子酸測定的瓶頸問題，同時將酚酸的檢測對象擴大到15種，操作更加簡便，靈敏度及準確度都有了較大提高。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

沒食子酸、原兒茶酸、兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶酸、丁香酸、對-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水揚酸、肉桂酸、槲皮素等，采購于SIGMA試劑公司。

Oasis HLB固相萃取柱(1 mL)，Oasis MAX固相萃取柱 (3 mL)，均購于Waters公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(2695型，帶有waters 2489紫外/可見檢測器，美國Waters公司)，固相萃取裝置(WIN SPE12，北京萊伯泰科儀器公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱 ZORBAX ODS柱 4.6 mm×250 mm，5 μm。流動相A:0.1%乙酸-甲醇溶液，流動相B:1%乙酸-水溶液。流動相洗脫梯度程序:0～25 min，10% ～30%A;25 ～40 min，30%A;40 ～60 in，30% ～60%A;60～61 min，60% ～10%A;61～75 min，10%A。流速 v=1.0 mL/min，柱溫:30℃，檢測波長 280 nm，進樣量 10 μL。

1.4 標樣的配制

混標儲備液1:分別稱取0.05 g沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、綠原酸、阿魏酸、丁香酸、對香豆酸、咖啡酸于同一燒杯中，用甲醇溶解后，定容于100 mL容量瓶中，該標準儲備液濃度為500 mg/L。

混標儲備液2:各稱取0.1 g肉桂酸、香草酸、兒茶酸、水揚酸于同一燒杯中，用甲醇溶解后，定容于100 mL容量瓶中，該標準儲備液濃度為1 000 mg/L。

芥子酸標準儲備液:稱取0.01 g芥子酸，用甲醇溶解后定容至100 mL，該標準儲備液濃度為100 mg/L。

表兒茶酸標準儲備液:稱取0.001 g表兒茶酸，用甲醇溶解后定容至10 mL，該標準儲備液濃度為100 mg/L。

上述各標準溶液于4℃冰箱中儲存，各標準使用液現用現配。

1.5 樣品制備

Waters Oasis HLB柱(1 mL)經1 mL甲醇活化、l mL水(含1%乙酸)洗后，取1 mL經超聲波除氣的啤酒樣品上樣，調整流速1 mL/min，然后再經1 mL水(含1%乙酸)洗后，用2 mL酸化甲醇(含1%乙酸)洗脫，收集洗脫液，經0.45 μm膜過濾后，上機檢測。

Waters Oasis MAX柱(3 mL)經3 mL甲醇活化后，用3 mL水淋洗，取1 mL經超聲波除氣的啤酒樣品上樣，用3 mL 2%的氨水淋洗以鎖定目標，之后用3 mL甲醇淋洗;最后3 mL 2%的酸化甲醇洗脫，收集洗脫液，經0.45 μm膜過濾后，上機檢測。

2 結果與討論

2.1 固相萃取條件的優化

2.1.1 固相萃取柱的選擇

酚酸是一類帶有酚類基團的有機酸，具有一定的極性，在不同的溶劑中具有不同的分配系數;同時酚酸又具有一定的弱酸性，在不同氫離子濃度下會保持不同的離解狀態。因此，在本文的研究中選取了反相HLB柱和離子交換模式的MAX柱兩種類型的萃取柱，以2 mg/L的混標代替啤酒樣品進行實驗。

使用HLB固相萃取柱的實驗中，標樣經固相萃取操作后上機檢測，所有組分的回收率均大于90%。在使用MAX萃取柱的實驗中，沒食子酸、兒茶酸、丁香酸均沒有流出，表兒茶酸回收率最高達到88%，其余組分的回收率則在20%～60%之間;當使用酸性更強的三氯乙酸-甲醇作為洗脫液時，各組分的回收率可略有提升，但除表兒茶酸和香草酸回收率大于80%，其余組分回收率均較低。因此本文的研究選用HLB固相萃取柱作為樣品制備用小柱。

2.1.2 淋洗液的選擇

啤酒樣品上樣后，對萃取小柱進行水淋洗以去除樣品中的干擾雜質組分。圖1為經過水洗與不經水洗處理后的樣品色譜圖。從圖1可以明顯看出，水洗操作能有效去除樣品背景雜質，其中對于沒食子酸色譜峰的準確定量顯得尤為關鍵。

圖1 經過水洗與不經水洗處理后的樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of samples with/without washing with water

為了考察水洗操作對于目標組分的影響，本文以2 mg/L的混標溶液替代樣品進行固相萃取操作，接收淋洗液進行酚酸含量分析，結果見圖2。從圖2可以看出，除沒食子酸外，其余酚酸化合物在水洗操作時均沒有流失。重復6次實驗，計算出沒食子酸損失率在7%～10%之間。

圖2 固相萃取過程水淋洗對于酚酸組分的影響對比圖Fig.2 Comparison chromatograms for the effect of washing on phenolic acid

本研究中對比了超純水與酸化水淋洗對沒食子酸的影響。配制2.0 mg/L的沒食子酸標準溶液，取兩支SPE固相萃取柱，按2.5中所述進行上樣操作，其中一支用超純水淋洗，另一支用酸化水淋洗。實驗重復進行3次。經檢測，使用超純水淋洗的沒食子酸含量均值為1.45 mg/L，而使用酸化水淋洗的沒食子酸含量均值為1.92 mg/L。從中可以看出，淋洗用水的酸性會影響到對酚酸的測定，這是由于酚酸屬于弱酸性物質，在不同氫離子濃度下會保持不同的離解狀態，當樣品在酸性條件下時，酚酸主要以分子形式存在，所以在樣品萃取凈化過程中，應避免酚酸以離子形式發生損失，因此，水洗操作步驟應使用酸化水(含1%乙酸)。

2.1.3 樣品pH值對測定的影響

酚酸是一類有機弱酸，因此當體系溶液中H+濃度增加時，會使酚酸物質更大程度地呈分子形式存在。在固相萃取過程中，保持樣品在低pH值會更有利于酚酸類化合物在反向保留模式的萃取柱上的保留行為。文獻［4］和［6］在作SPE柱處理前需要將啤酒樣品的pH調為1.5，為了驗證調節啤酒pH值對檢測結果的影響，本文做了比較試驗。取同一瓶啤酒樣品，經超聲除氣后，其中一部分樣品用36%的鹽酸調至pH1.5，另一部分為原樣，兩者通過固相萃取處理后進樣分析，檢測結果見表1。

由表1中看出，啤酒原樣和調整啤酒pH為1.5的樣品中酚酸測定結果沒有明顯差異。這是由于啤酒屬于弱酸性飲料，pH值通常在4.2～4.3，其緩沖容量很大，而酚酸化合物酸性較弱，在啤酒溶液中解離趨勢變小，主要以分子形式存在，因此進一步強化啤酒樣品的酸性對于酚酸的分析結果不會產生影響，在本研究中未對啤酒的pH作調整。

2.2 組分的分離與定性

通過標準樣品的保留時間比對并結合文獻數據對樣品組分峰作定性分析。典型的混標及啤酒樣品色譜圖見圖3。有文獻報道啤酒中含有一定量的槲皮素［4-6］，其來源為啤酒釀造大麥。肉桂酸則是另一來自酒花的酚酸化合物，在本研究中，肉桂酸的出峰保留時間與文獻中槲皮素的保留時間較為接近，為對組分峰的確切定性，進行了驗證實驗。取同一經脫氣的啤酒樣品分為3份，1份添加2 mg/L的肉桂酸，1份添加2 mg/L的槲皮素，最后1份最為本底，按2.3進行樣品制備后上機檢測，結果見表2。

表1 調酸與不調酸樣品的檢測結果(mg/L)Table 1 Phenolic acid content in beer and acidized beer

圖3 酚酸的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of phenolic acid

表2 肉桂酸和槲皮素的確證實驗檢測結果Table 2 Corroboration test of cinnamic acid and quercetin

由表2結果可以看出，在單獨添加肉桂酸的樣品中，50.73 min處的色譜峰面積較本底峰面積有明顯增加，而單獨添加檞皮素的樣品中，50.73 min的色譜峰面積并無增長。

為了更確切地驗證槲皮素的出峰情況，配制了槲皮素的單標溶液于相同色譜條件下進行分析，其結果是在本文色譜條件下，槲皮素沒有出峰。推斷其原因可能是:槲皮素的水溶性差，在做樣品配制時需純甲醇溶劑才能保持溶液的澄清，而在本文中的色譜條件，甲醇流動相的最大洗脫梯度僅達到60%，而這一梯度維持時間很短，在這一強度下不足以將槲皮素洗脫出來，這可能是造成其不出峰的原因，槲皮素應吸附在柱內未流出。

由此，在本文的色譜條件下，50.73 min處的色譜峰確認為肉桂酸，而非槲皮素。

2.3 回歸方程、線性范圍與檢出限

配制含有15種酚酸組分的系列混合標準溶液，在2.3色譜條件下依次進樣，各組分的保留時間、回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限見表3。

表3 15種酚酸組分的保留時間、回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限Table 1 Retention time，linear equations，correlation coefficients，linear range and LODs of 15 phenolic acids

2.4 回收率與精密度

取同一瓶啤酒樣品，用HLB小柱按2.5方法處理后上機檢測，實驗進行3次平行，計算測定結果的相對標準偏差。同時另取約20 mL啤酒樣品于100 mL容量瓶中，加入酚酸標準溶液，搖勻，并在室溫下放置24 h，樣品測定前再充分混勻，按2.5方法進行樣品制備，上機檢測。結果見表4。

在做方法回收率的實驗過程中，如加入標準樣品后將容量瓶上下倒置20次，即進行樣品處理，實驗結果是各酚酸組分的回收率僅在40～80%之間，遠不能滿足方法要求。分析原因可能是，啤酒樣品酒精度低，加入的標準樣品與酒液沒有達到充分混勻和溶解的狀態。將搖勻后的加標樣品于室溫下靜置24 h，進行固相萃取前再充分振搖，然后進行樣品測定，即得到表4中結果，測定的回收率良好。

表4 方法回收率及精密度試驗結果(n=3)Table 4 Recovery and RSD of 15 phenolic acids

2.5 樣品的測定

選取了6種典型市售啤酒樣品測定酚酸含量，結果見表5。

表5 市售啤酒樣品酚酸含量檢測結果(mg/L)Table 5 Phenolic acids contents in 6 commercial beers

應用本方法測定了6個市售啤酒，結果發現，不同啤酒中各酚酸物質的含量有一定的區別，可能與其生產原料、加工工藝的不同有關。從總體來看，各啤酒中的沒食子酸、兒茶酸、丁香酸、對香豆酸和阿魏酸的含量較高。

3 結論

建立了啤酒中15種酚酸同時分離并定量的分析方法。使用Oasis HLB小柱對啤酒樣品進行固相萃取處理，在優化的條件下可有效提取啤酒中的酚酸化合物，使用酸化水對固相萃取柱進行淋洗能有效去除啤酒中雜質對目標組分分離的影響。本研究同時對槲皮素和肉桂酸的確切定性進行了有效確認。方法有較好的精密度和回收率，同時具有法操作簡便、重復性好等特點，適用于啤酒中酚酸含量的準確測定。至于啤酒酚酸與抗氧能力之間的相關性，則是下一步研究的目標。

致謝:本研究的實驗及論文撰寫得到了中國食品發酵研究院胡國棟教授和蔡心堯教授的大力幫助，在此表示感謝!

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