5種天然多酚類化合物抗氧化活性的比較*

范金波，蔡茜彤，馮敘橋，侯宇，于曉鳳，姜沫

(渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)

流行病學研究表明，日常飲食與營養對于一些疾病的預防和治療發揮著重要的作用［1］。據報道攝入足量的果蔬制品可以降低心腦血管、癌癥等疾病的發病率，已被證實上述功能活性主要源于果蔬中豐富多樣的多酚成分［1］。果蔬中的多酚成分作為天然的抗氧化劑能夠阻止活性氧和活性氮的增加，調節機體內氧化劑和抗氧化劑的穩態，防止或減弱生物大分子的氧化損傷，從而達到降低許多慢性疾病的發病率以及延緩衰老的作用［2］。此外，多酚成分能夠形成食品中的苦味、澀味、香味、顏色以及氧化穩定性等，是果蔬、谷物等食品感官質量和營養質量的決定因素［3］。

多酚類化合物指芳香烴中苯環上一個或多個氫原子被羥基取代所生成的化合物，是植物的重要次生代謝產物，主要包括酚酸、黃酮類、芪、單寧和木脂素類，其中酚酸又包括羥基肉桂酸和羥基苯甲酸類，黃酮類又分為黃酮醇、黃酮、黃烷醇(兒茶素)、黃烷酮、花青素和異黃酮類［4］。天然來源的多酚成分具有多樣的生物學活性，如抗氧化、抗輻射、抗癌、降血壓等，對人類的健康起著非常重要的作用［5］。

多酚類物質的抗氧化性一直是國內外研究的熱點，但主要以多酚混合體系的研究為主，對多酚類物質單體的抗氧化能力研究相對較少［6］。本文選用羥基肉桂酸、芪和黃酮的典型代表咖啡酸、白藜蘆醇和蘆丁以及根皮素和根皮苷等常見多酚類物質的單體作為研究對象，并以VC、BHT和EDTA等為對照，研究其總抗氧化能力、DPPH和ABTS自由基清除活性、鐵離子還原能力以及金屬離子螯合能力等，通過多種體外體系對上述幾種多酚類物質的抗氧化活性進行綜合評價，分析各多酚類化合物的抗氧化機理，為其進一步的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

UV-2700紫外-可見光分光光度計，日本 SHIMADZU公司;JA5003電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;Centrifuge 5804 R冷凍離心機，德國eppendorf公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;VORTEX-6電動振蕩器，上海其林貝爾有限公司;FE-20實驗室pH計，美國梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

咖啡酸、蘆丁、白藜蘆醇、根皮素、根皮苷、2，2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)，百靈威科技有限公司;2，2'-聯氨-雙 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、菲洛嗪(Ferrozine)，合肥博美生物有限公司;K3Fe(CN)6、四水合鉬酸銨，國藥集團化學試劑有限公司;2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，阿拉丁試劑有限 公 司;乙 醇、FeCl3、FeCl2、冰 醋 酸、K2S2O8、NaH2PO4、Na2HPO4等試劑均為分析純。

1.2 總抗氧化能力

總抗氧化能力(TAC)的測定運用鉬酸銨法，抗氧化物質可以將Moボ還原為Moブ，并且在酸性條件下形成綠色Moブ的磷酸鹽。配制鉬酸銨反應體系:分別稱取2.13 g Na3PO4、0.99 g四水合鉬酸銨、6.67 mL濃H2SO4溶于200 mL水中，使其濃度依次為28 mmol/L、4 mmol/L和 0.6 mol/L，混和均勻。配制0.1 mg/mL的樣品溶液及0.01～0.09 mg/mL的VC溶液，將0.3 mL待測物加入到3 mL的鉬酸銨反應體系中，將混合液混勻并于95℃恒溫水浴90 min，反應液冷卻后，于695 nm處測定吸光值，以不加樣品的空白試劑調零［7］。被測物的總抗氧化能力以VC的當量來表示［7］。

1.3 DPPH自由基清除活性

DPPH·在有機溶劑乙醇中是一種穩定的自由基，其孤對電子在517 nm附近有強吸收，自由基清除劑可與孤對電子進行配對，使吸收消失或減弱，測定吸收減弱的程度即可反映自由基清除劑的活性［8］。稱取9.85 mg DPPH以無水乙醇定容至250 mL作為DPPH工作液，在反應體系中，于10 mL試管中加入200 μL不同濃度的樣品溶液，再加入2 mL DPPH工作液，振蕩搖勻，于室溫下避光靜置30 min，測定517 nm處的吸光值，以加入等量的超純水作為空白對照［9］。以樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進行線性擬合，計算IC50值，其中IC50值定義為清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度，所需濃度越低，表明該物質抗氧化性越強［10］。

DPPH自由基清除率/%=(1-AS/A0)×100

其中:AS為樣品管的吸光值;A0為對照管的吸光值。

1.4 ABTS自由基清除活性

稱取0.192 0 g ABTS、0.033 1 g K2S2O8于燒杯中，并用去離子水定容至50 mL，使ABTS濃度為7 mmol/L，過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L，將該溶液于室溫下暗處靜置12～16 h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)稀釋至734 nm處吸光值為0.70［11］。反應體系中，于10 mL試管中加入20μL不同濃度的樣品，再加入2 mL ABTS反應液，振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，測定反應液在734 nm處的吸光值，以不加入樣品的ABTS自由基溶液為空白對照，并計算IC50值。

ABTS自由基清除率/%=(1-AS/A0)×100

其中:AS為樣品管的吸光值;A0為對照管的吸光值。

1.5 鐵離子還原能力(FRAP)

稱取0.93 g三水合乙酸鈉加入4.8 mL冰醋酸，以超純水定容至300 mL;稱取0.093 7 g TPTZ，加入99 μL濃HCl，以超純水定容至30 mL;稱取0.162 1 g FeCl3，加入30 mL超純水溶解搖勻。將以上3種溶液混合即得FRAP工作液。以超純水配制0.05 mg/mL樣品、BHT和VC溶液，于10 mL試管中分別加入0、100、200、300、400 μL(分析時換算成濃度)的待測物，再加入2mL FRAP工作液，振蕩搖勻，37℃下靜置10 min，測定593 nm 處吸光值［12］。

1.6 金屬離子螯合能力

以待測物對二價鐵離子(Fe2+)的清除活性來評價其金屬離子螯合能力。Fe2+可與菲咯嗪(ferrozine)反應生成紫紅色的Fe2+-ferrozine絡合物，并于562 nm處有最大吸收，當反應體系中存在具有金屬螯合能力的物質時，Fe2+-ferrozine絡合物的形成受到抑制，表現為吸光值的降低［13］。參照Chung等的測定方法［14］，向2.4 mL不同濃度的樣品溶液中依次加入現配的 30 μL 2 mmol/L 的 FeCl2溶液和 60 μL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液，混合均勻后室溫靜置10 min，測定混合液在562 nm處的吸光值，以等量的超純水代替樣品溶液作為空白對照。

金屬離子螯合率/%=(1-AS/A0)×100

其中:AS為樣品管的吸光值;A0為對照管的吸光值。

1.7 統計學分析

所有實驗重復測定3次，各項指標的數據均用Origin 8.5軟件處理作圖，并采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。測量數據均以Mean±S.D.表示，P＜0.05認為有顯著差異，P＜0.01認為具有極顯著差異。

2 結果與討論

2.1 總抗氧化能力

VC的標準曲線及各種多酚類物質的VC當量，如圖1-a、圖1-b所示。由圖1-a可知，標準曲線在所選濃度范圍內有較好的線性關系R2=0.991 2，如圖1-b所示，幾種多酚類物質在濃度為0.1 mg/mL時，總抗氧化能力大小依次為咖啡酸＞白藜蘆醇＞蘆丁＞根皮苷＞根皮素，且上述5種多酚類物質總抗氧化能力的差異極顯著(P＜0.01)，其中咖啡酸的抗氧化能力最高，達到(1.873±0.022)mg VCeq/mg;其余多酚類物質的VC當量依次為(0.810±0.015)、(0.684±0.018)、(0.414±0.037)、(0.199±0.012)mg VCeq/mg。

圖1 VC標準曲線(a)和5種多酚類化合物的VC當量(b)Fig.1 The standard curve of VC(a)and VCequivalent of five polyphenols(b)

咖啡酸和白藜蘆醇的分子結構中均含有苯乙烯基結構，且均含有3個羥基，差別在于咖啡酸相比于白藜蘆醇少一個苯環，相同質量濃度的咖啡酸比白藜蘆醇具有更多的羥基和乙烯基，表現為咖啡酸具有更強的總抗氧化能力。蘆丁分子結構中含有10個羥基，根皮苷有7個羥基，根皮素有4個羥基，相同質量濃度條件下，羥基數目大小依次為蘆丁＞根皮苷＞根皮素，與3種物質總抗氧化能力相一致。由此可見，多酚類物質的總抗氧化能力與乙烯基和羥基的數目有著一定的關系。Sokó?- ??towska 等報道［15］，多酚類化合物的性質和應用都根源于其獨特的化學結構，其中酚羥基結構是多酚類化合物的有效基團之一，與本研究結果相符。

2.2 DPPH自由基清除活性

以各樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量的線性擬合曲線如圖2所示。如圖2-a～圖2-f所示，咖啡酸、蘆丁、白藜蘆醇、根皮素和根皮苷以及2個陽性對照BHT和VC在所選濃度范圍內均有較好的線性關系，根據擬合曲線所求得各抗氧化劑的IC50值如表1所示。

圖2 不同濃度的咖啡酸(a)，蘆丁(b)，白藜蘆醇(c)，根皮素(d)，根皮苷(e)，BHT(f)和VC(g)對DPPH自由基的清除能力及它們的線性擬合結果Fig.2 Dose-dependent inhibitions of caffeine acid(a)，rutin(b)，resveratrol(c)，phloretin(d)，phlorizin(e)，BHT(f)and VC(g)on DPPH free radicals and their linearity correlation

如表1所示，在DPPH自由基清除實驗中，各抗氧化劑均具有較強的清除DPPH自由基的能力，大小依次為:咖啡酸≈VC≈蘆丁＞白藜蘆醇＞BHT＞根皮素＞根皮苷，通過鄧肯式方差分析得到，咖啡酸、VC、蘆丁在統計學上沒有顯著差異(P＞0.05)，其余各樣品之間均存在顯著差異(P＜0.05)。Karaman等［16］研究表明植物多酚可以作為還原劑、氫原子供體和氧自由基清除劑，個別的多酚類物質還具有金屬離子螯合能力;Vignoli等［17］報道咖啡飲料中酚酸的含量與DPPH自由基的清除能力呈極顯著的正相關性;Hou等［18］研究表明分子中羥基的位置與其自由基清除活性有關;Huang等［19］報道生物系統中的pH和代謝產物均可使多酚類化合物的結構發生改變，從而影響其抗氧化活性。由此可見，多酚類化合物具有清除自由基的能力，且清除能力大小受多種因素控制。

表1 5種多酚化合物，BHT和VC清除DPPH和ABTS自由基的IC50值Table 1 IC50values of five phenolic compounds，BHT and VCdetermined by DPPH assay and ABTS assay

2.3 ABTS自由基清除活性

本實驗利用過硫酸鉀將ABTS氧化成相對穩定的藍綠色ABTS水溶性自由基，ABTS自由基既是親水型化合物又是親脂型化合物，所以較DPPH自由基更容易反應，ABTS+·的清除是電子轉移過程，體系中的抗氧化劑與其反應將會使溶液褪色，表現為吸光值的降低［20］。

以各抗氧化劑濃度為自變量，自由基清除率為因變量的線性擬合曲線如圖3所示。

從圖3中可以看出各抗氧化劑在選定的濃度范圍內均有較好的線性關系。根據擬合曲線所求得各抗氧化劑的IC50值見表1。

在ABTS自由基清除實驗中，各樣品均具有較強的ABTS自由基清除能力，大小依次為:白藜蘆醇＞BHT＞根皮苷＞蘆丁≈根皮素＞咖啡酸＞VC，通過方差分析得到白藜蘆醇清除ABTS自由基能力最強，極顯著高于陽性對照BHT和VC(P＜0.01);蘆丁和根皮素之間沒有顯著差異(P＞0.05)，其他樣品之間均存在顯著差異。通過SPSS相關性分析可知5種多酚對上述兩種自由基的清除能力相關性較低(R2=0.1)，Wootton-Beard 等［21］研究 23 種果蔬飲料對ABTS自由基和DPPH自由基清除能力，發現二者相關性較低(R2=0.45)，與本實驗研究結果一致。張逸波等［22］得到BHT清除ABTS的IC50值為(246.9±10.5)μmol/L即(0.054±0.002)mg/mL，與本實驗結果相近，實驗結果的差異可能是由于氧化體系不同所致。

2.4 還原能力

由圖4可知，隨著樣品濃度的增加，吸光度值逐漸升高，即鐵離子還原能力逐漸升高，由方差分析可知，當濃度為0.002 mg/mL時，咖啡酸與VC之間抗氧化性并沒有顯著差異(P＞0.05)，但二者均極顯著高于其他多酚類化合物和BHT(P＜0.01);當濃度為0.004、0.006、0.008 mg/mL 時，各抗氧化劑之間均存在極顯著差異(P＜0.01)。各樣品鐵離子還原能力大小依次為:VC＞咖啡酸＞BHT＞白藜蘆醇＞蘆丁＞根皮素＞根皮苷，通過相關性分析可知5種多酚類化合物FRAP與TAC相關性較高(R2=0.81)，且與DPPH自由基清除能力相關性較低(R2=0.64)與Wootton-Beard 等［21］研究結果相近。

2.5 金屬離子螯合能力

人體內過量的金屬離子可引起脂質過氧化，并進一步誘導自由基和脂質過氧化物的產生，因此，螯合金屬離子可通過間接的途徑達到抗氧化和抗自由基的目的［23］。研究中發現，咖啡酸、根皮素和根皮苷不具有金屬離子螯合能力，隨其濃度的改變，吸光值之間差異不顯著(P＞0.05)，蘆丁和白藜蘆醇的金屬螯合能力如圖5所示。

圖3 不同濃度的咖啡酸(a)，蘆丁(b)，白藜蘆醇(c)，根皮素(d)，根皮苷(e)，BHT(f)和VC(g)對ABTS自由基的清除能力及它們的線性擬合結果Fig.3 Dose-dependent inhibitions of caffeine acid(a)，rutin(b)，resveratrol(c)，phloretin(d)，phlorizin(e)，BHT(f)and VC(g)on ABTS free radicals and their linearity correlation

圖4 不同濃度咖啡酸，蘆丁，白藜蘆醇，根皮素，根皮苷，BHT和VC的鐵離子還原能力Fig.4 Dose-dependent ferric reducing ability of caffeine acid，rutin，resveratrol，phloretin，phlorizin，BHT and VC

從圖5中可以看出蘆丁和白藜蘆醇都有一定的螯合金屬離子的能力，且蘆丁的金屬離子螯合能力高于白藜蘆醇，由于繼續增加濃度清除率增加緩慢，所以不利于IC50值得計算，考慮可能是多酚的溶解性限制了其金屬螯合能力的發揮。陽性對照BHT和VC具有較強的金屬離子螯合能力，IC50值分別達到了(6.9±0.02)μg/mL(R2:0.981)和(5.1±0.05)μg/mL(R2:0.993)，與 Gulcin等人研究結果基本一致［24］。Ebrahimzadeh 等［25］報道，果蔬提取物中酚酸和黃酮類成分與鐵離子螯合能力相關性較弱(R2=0.4)，Ghasemi等［26］研究表明一些多酚提取物與金屬離子螯合能力具有很好的線性關系，但也存在一些多酚提取物無金屬離子螯合能力。可見金屬離子螯合能力與黃酮和酚酸的整體結構以及羥基的位置等有關，并不是黃酮或酚酸等多酚類化合物的共性。

3 結論

以5種體外體系對咖啡酸、蘆丁、白藜蘆醇、根皮素和根皮苷等多酚類化合物的抗氧化活性進行評價。結果表明咖啡酸具有極強的總抗氧化能力，0.1 mg/mL時達到(1.873±0.022)mg VCeq/mg;很強的DPPH自由基清除能力［IC50(0.023±0.004)mg/mL］，極顯著高于陽性對照BHT;很強的鐵離子還原能力，極顯著高于BHT。白藜蘆醇具有極強的ABTS自由基清除能力［IC50(0.056±0.006)mg/mL］，極顯著高于陽性對照BHT和VC。蘆丁金屬離子螯合能力最強，白藜蘆醇次之，但遠不及陽性對照BHT和EDTA，其余3種多酚化合物不具有金屬離子螯合能力。

圖5 不同濃度蘆丁(a)和白藜蘆醇(b)的金屬離子螯合能力Fig.5 Dose-dependent ferrous ions chelating activity of rutin(a)and resveratrol(b)

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