3種食用菌固態(tài)發(fā)酵降解杜仲半纖維素、纖維素和木質(zhì)素*

化雪艷，李碩，唐克華，劉文柱

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界，427000)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)又名木棉(木草圖經(jīng))，是杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，為我國(guó)特有的藥用植物，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物［1］;其皮和葉中含有多種藥用成分，如綠原酸［2］、黃酮［3］、桃葉珊瑚苷［4］，以及多種維生素、氨基酸，豐富的鐵、鈣、鉀、鋅、鎂、硒等礦物元素。具有降血壓、抗衰老［5］、增加肝臟細(xì)胞活性、恢復(fù)肝臟功能、增強(qiáng)腎細(xì)胞、通便、促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)血液循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理作用［6］;對(duì)高血壓，高血脂，心血管病，肝臟病，腰、關(guān)節(jié)痛，哮喘，腎虛，便秘，脫發(fā)，老年綜合癥均有顯著療效［7］，對(duì)肥胖治療亦有效果［8］。

中藥材及其藥渣［9-10］常被用來(lái)栽培食用菌。杜仲早已用來(lái)栽培食用菌:杜仲木耳［11］含有綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸等活性成分;杜仲香菇［13-14］口感鮮美，營(yíng)養(yǎng)成分豐富。杜仲葉渣［19-20］栽培食用菌，生長(zhǎng)良好且有較好的生物學(xué)效率。本試驗(yàn)以杜仲葉渣及杜仲皮為基質(zhì)，研究3種食用菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)原料的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解規(guī)律。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

金針菇、猴頭菇，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心;平菇，由本研究團(tuán)隊(duì)從杜仲葉渣廢棄物上自然生長(zhǎng)的平菇子實(shí)體采取組織分離與純化制備;杜仲葉渣，張家界市恒興生物科技有限公司提供;杜仲皮，購(gòu)自慈利縣景龍橋鄉(xiāng)藥材商。

中性洗滌劑［15］，蒽酮試劑，地衣酚試劑［22］，均按規(guī)范配制。葡萄糖，木糖，HCl、H2SO4等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

日立U-3900分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司;HH型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;JA2003電子天平，上海良平儀表儀器有限公司;SM-52電熱高壓滅菌鍋，日本 YAMATO公司;BCM-1000A生物潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司;YB-1000A型高速多功能粉碎機(jī)，上海力箭機(jī)械有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種制備

固體菌種:PDA培養(yǎng)基［23］，將購(gòu)買或自行組織分離培養(yǎng)的菌種擴(kuò)繁2次，然后無(wú)菌接種到PDA固體培養(yǎng)瓶中。

液體菌種:不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，分裝于錐形瓶中，滅菌，靜置冷卻，接種固體菌種，置于搖床以80 r/min的振蕩速度培養(yǎng)10 d，再接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)瓶時(shí)濾取菌絲球，然后無(wú)菌接種。

2.2 培養(yǎng)基制作

杜仲皮的預(yù)處理:杜仲皮洗凈，陽(yáng)光下曝曬2 d，粉碎，過(guò)2 mm樣品篩，去掉杜仲膠及粗顆粒，備用。

杜仲葉渣烘曬結(jié)合干燥至輕捏即碎，輕度粉碎成小塊(不必太細(xì))。稱取干燥粉碎杜仲葉渣，按照每份杜仲葉渣的總質(zhì)量，分別加入其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的KH2PO4和Ca(OH)2，2%蔗糖，以及2%的石膏粉，攪拌混勻。加入自來(lái)水，反復(fù)揉搓攪勻，然后以塑料膜覆蓋4～6 h，用前根據(jù)經(jīng)驗(yàn)微調(diào)整基質(zhì)水分在50% ～65%。基質(zhì)裝入洗凈烘干的培養(yǎng)瓶中時(shí)，要求裝料的松、緊適度，每瓶的裝料量盡可能保持一致。將裝料完畢的培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋，121℃滅菌60 min，冷卻后無(wú)菌接入菌種。每種食用菌接種30瓶，放入培養(yǎng)室，室溫培養(yǎng)。

2.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物制備

2.3.1 杜仲葉渣發(fā)酵產(chǎn)物

對(duì)葉渣培養(yǎng)瓶接入菌種進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，及時(shí)挑出雜菌污染培養(yǎng)瓶。待菌絲滿瓶(以菌絲穿透瓶?jī)?nèi)基質(zhì)底部為標(biāo)準(zhǔn))后，記錄培養(yǎng)時(shí)間，隔15天后第1次取樣，不同菌種的滿瓶培養(yǎng)瓶隨機(jī)取4瓶，掏出其培養(yǎng)物并置烘箱以50～60℃烘至恒重，粉碎，過(guò)40目篩，保存?zhèn)溆谩５?次、第3次培養(yǎng)物的取樣，分別較前一次的取樣時(shí)間延長(zhǎng)15 d，取樣方式及處理方法均同。

2.3.2 杜仲皮發(fā)酵產(chǎn)物

將不同菌類的固體菌種和液體菌種分別接入裝有杜仲皮基質(zhì)的培養(yǎng)瓶，觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，及時(shí)挑出雜菌污染培養(yǎng)瓶。待菌絲滿瓶后，記錄培養(yǎng)時(shí)間，隔20天后取樣，每類菌的液體、固體菌種培養(yǎng)瓶每次各取4瓶，樣品的后續(xù)處理方法同葉渣發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物的。

2.4 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

參照王玉萬(wàn)的定量分析方法，即:中性洗滌劑法、2 mol/L HCl水解法、體積分?jǐn)?shù)72%H2SO4水解法、地衣酚比色定糖法和蒽酮比色定糖法，綜合應(yīng)用。

2.4.1 纖維素、半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.1.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.100 g在90℃烘至恒重的木糖，溶于少量蒸餾水，移至1 000 mL容量瓶中，定容，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。此標(biāo)準(zhǔn)液以蒸餾水稀釋后得到質(zhì)量濃度分別為 0、5、10、15、20、25 μg/mL 的稀釋液。在刻度試管中加入2 mL標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋液與8 mL地衣酚試劑，混勻后在沸水浴中保持20 min，冷水快速冷卻至室溫，掃描波長(zhǎng)并測(cè)定吸光度，同時(shí)做空白試驗(yàn)。掃描顯示在666 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。以木糖檢測(cè)濃度(Y1)為橫坐標(biāo)，666 nm處的吸光度(X1)為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y1=0.045 3 X1+0.052 7，R12=0.999 6。

2.4.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.200 g在90℃烘至恒重的葡萄糖，溶于蒸餾水，移至1 000 mL容量瓶中，定容，制得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。適當(dāng)稀釋后，得到質(zhì)量濃度為0、10、20、40、60、80、100、200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。在試管中加入2 mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，蒽酮試劑8 mL，混勻后放入沸水浴中加熱10 min，冷水快速冷卻，在620 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)做空白。以葡萄糖檢測(cè)濃度(Y2)為橫坐標(biāo)，620nm的吸光度(X2)為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y2=0.005 7 X2+0.118 6，R22=0.999 5。

2.4.1.3 半纖維素、纖維素、木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

各種固態(tài)發(fā)酵樣品按步驟處理，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法程序測(cè)定其吸光度。依據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出糖含量，乘系數(shù)0.9即得所測(cè)定樣品中的半纖維素的質(zhì)量。依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出糖含量，乘系數(shù)0.9即得所測(cè)定樣品中的纖維素的質(zhì)量。木質(zhì)素的質(zhì)量是根據(jù)灰化前、后的質(zhì)量差所得。

半纖維素、纖維素、木質(zhì)素在樣品中所占的質(zhì)量計(jì)算:

其中:Y，半纖維素(或纖維素，或木質(zhì)素)含量，mg/g;X1，樣品中的半纖維素(或纖維素，或木質(zhì)素)質(zhì)量，mg;X2，樣品質(zhì)量，g;X3，樣品的含水量，%。每次試驗(yàn)前均測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 杜仲葉渣及杜仲皮的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量

依據(jù)公式和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到杜仲葉渣的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是:9.83、39.00和164.67 mg/g，即杜仲葉渣中木質(zhì)素含量＞纖維素含量＞半纖維素含量，與文獻(xiàn)［18］報(bào)道一致;杜仲皮的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量分別是:32.30、108.31 和44.67 mg/g。

3.2 杜仲葉渣和杜仲皮固態(tài)發(fā)酵的菌絲滿瓶時(shí)間

表1為按方法培養(yǎng)的猴頭菇、金針菇和平菇發(fā)酵杜仲葉渣和杜仲皮的菌絲滿瓶時(shí)間。

表1 三種食用菌固態(tài)發(fā)酵杜仲的菌絲滿瓶培養(yǎng)時(shí)間/dTable 1 Full culturing time of hypha of three edible fungus/d

由表1可看出，3種食用菌在杜仲葉渣上生長(zhǎng)時(shí)，平菇生長(zhǎng)速度最快，金針菇次之，猴頭菇滿瓶時(shí)間最長(zhǎng)。經(jīng)觀察，猴頭菇在菌絲萌發(fā)階段生長(zhǎng)緩慢，但菌絲滿瓶后，呈快速生長(zhǎng)。液體菌種和固體菌種在杜仲皮基質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)，猴頭菇液體菌種發(fā)酵的菌絲滿瓶時(shí)間比固體菌種發(fā)酵的提高4 d，存在較顯著差異;金針菇、平菇的液體菌種與固體菌種發(fā)酵的菌絲滿瓶時(shí)間差距在2 d之內(nèi)，差異不顯著。而一般情況下應(yīng)該是液體菌種滿瓶時(shí)間較短，也可能與裝瓶時(shí)裝料較緊，菌種萌發(fā)之后因透氣性較差導(dǎo)致的吃料或前進(jìn)速度受到明顯影響。

3.3 三種食用菌對(duì)杜仲葉渣半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的發(fā)酵降解規(guī)律

3種食用菌對(duì)杜仲葉渣半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的固態(tài)發(fā)酵降解比較見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

圖1 杜仲葉渣培養(yǎng)基質(zhì)的半纖維素含量變化Table 1 The variation on the mass fraction of hemicellulose in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

圖2 杜仲葉渣培養(yǎng)基質(zhì)的纖維素含量變化Table 2 The variation on the mass fraction of cellulose in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

圖3 杜仲葉渣培養(yǎng)基質(zhì)的木質(zhì)素含量變化Table 3 The variation on the mass fraction of lignin in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

從圖1、圖2及圖3可知，杜仲葉渣經(jīng)過(guò)平菇、猴頭菇、金針菇的固態(tài)發(fā)酵，其半纖維素、纖維素和木質(zhì)素均有一定程度的降解。菌株不同，對(duì)半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解規(guī)律也是不同的［19］。

杜仲葉渣基質(zhì)經(jīng)過(guò)一段的發(fā)酵，其中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解效率如表2所示。

表2 杜仲葉渣基質(zhì)中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解效率Table 2 The degradation percent of hemicellulose，cellulose and lignin in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

對(duì)杜仲葉渣半纖維素的降解，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，猴頭菇呈明顯加快態(tài)勢(shì)，而平菇、金針菇對(duì)其的降解呈較緩慢變化趨勢(shì);3種食用菌中，猴頭菇最終可使55.29%的半纖維素降解，其生長(zhǎng)利用杜仲葉渣半纖維素的能力稍強(qiáng)于金針菇和平菇的。對(duì)杜仲葉渣纖維素的降解利用，猴頭菇與金針菇的利用能力基本相當(dāng)，都能利用80%左右，而平菇只能利用40.70%。對(duì)杜仲葉渣木質(zhì)素的降解利用，平菇遠(yuǎn)比金針菇和猴頭菇的能力強(qiáng)，這與文獻(xiàn)［20］報(bào)道平菇對(duì)木質(zhì)素有特異性降解結(jié)論相符。鞠洪波［21］研究云杉木質(zhì)素及纖維素降解時(shí)發(fā)現(xiàn)，金針菇對(duì)纖維素的降解能力較強(qiáng)，對(duì)木質(zhì)素的降解能力較弱，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。總體而言，猴頭菇發(fā)酵中優(yōu)先利用杜仲葉渣的半纖維素和纖維素，金針菇則優(yōu)先利用杜仲葉渣的纖維素，而平菇是優(yōu)先利用杜仲葉渣的木質(zhì)素和纖維素。

3.4 固體菌種和液體菌種對(duì)杜仲皮發(fā)酵降解的差異

3種食用菌的固體菌種和液體菌種固態(tài)發(fā)酵降解杜仲皮半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量變化情況如圖4、圖5和圖6。

圖4 杜仲皮培養(yǎng)基質(zhì)的半纖維素含量變化Table 4 The variation on the mass fraction of hemicellulose in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver

圖5 杜仲皮培養(yǎng)基質(zhì)的纖維素含量變化Table 5 The variation on the mass fraction of cellulose in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver

圖6 杜仲皮培養(yǎng)基質(zhì)中木質(zhì)素含量變化Table 6 The variation on the mass fraction of lignin in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver

經(jīng)過(guò)每種食用菌不同類菌種的固態(tài)發(fā)酵，杜仲皮中這三者的含量均有下降。

表3 固體與液體菌種對(duì)杜仲皮基質(zhì)中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解效率/%Table 3 The degradation efficiency of hemicellulose，cellulose and lignin in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver/%

根據(jù)表3可知，固體菌種和液體菌種對(duì)半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解幅度是有差別的，其中，差別最大的是猴頭菇菌種。除木質(zhì)素外，半纖維素、纖維素基本均是固體菌種的降解率小于液體菌種的，這主要是因?yàn)橐后w菌種流動(dòng)性強(qiáng)，可覆蓋在培養(yǎng)料表面及不同深度。由于杜仲皮中纖維素和木質(zhì)素所占比例較大，綜合而言，平菇、猴頭菇固體菌種較適于發(fā)酵降解杜仲皮的木質(zhì)素，猴頭菇、金針菇的液體菌種較適于皮的纖維素發(fā)酵降解，3種菇的2類菌種對(duì)皮的半纖維素發(fā)酵降解能力差異較小。

4 結(jié)論

3種食用菌以杜仲葉渣和杜仲皮為培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)，平菇對(duì)杜仲葉渣和皮的木質(zhì)素有較特異的降解作用，金針菇、猴頭菇對(duì)杜仲葉渣和皮的纖維素利用能力較強(qiáng)，而且金針菇、猴頭菇的液體菌種發(fā)酵降解纖維素的能力顯著優(yōu)于固體菌種的。

有研究表明，食用菌的菌絲體成分與子實(shí)體成分相當(dāng)或者高于子實(shí)體［22-23］。因此，杜仲葉渣和皮的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素成分，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵有明顯的降解，并轉(zhuǎn)化為食用菌菌絲體營(yíng)養(yǎng)成分，有效地改善了做藥材的杜仲葉渣和皮的食用性能。

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