導(dǎo)致醬油脹袋微生物的分離與鑒定*

張小麗，蔣予箭，李鋒

1(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州，310018)

2(至味食品有限公司，浙江紹興，312050)

醬油是以黃豆(或豆粕)、小麥(或面粉、麩皮)為主要原料經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的一種調(diào)味品［1］。醬油富含氨基酸、糖分等營養(yǎng)物質(zhì)，如果生產(chǎn)過程中原料、容器或管道滅菌不徹底，灌裝及儲存過程中管理不善，容易使產(chǎn)品感染雜菌，導(dǎo)致醬油脹袋，特別是在春夏季環(huán)境氣溫高、濕度大時容易發(fā)生［2］。醬油脹袋不僅給生產(chǎn)企業(yè)帶來直接的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重影響到企業(yè)的信譽(yù)［3］。

未滅菌的醬油中含有多種微生物，細(xì)菌有芽孢桿菌、片球菌、乳酸菌等，其中芽孢桿菌的含量占首位［4］;酵母菌有耐高滲酵母菌、產(chǎn)膜酵母等;霉菌有黃曲霉、米曲霉等。對醬油進(jìn)行巴氏殺菌很難將那些耐性很強(qiáng)的微生物殺死，很容易殘留些產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的微生物而導(dǎo)致醬油脹袋。若能明確找到并鑒定出導(dǎo)致醬油脹袋的微生物，進(jìn)而了解微生物的特性，可以在很大程度上幫助企業(yè)解決醬油脹袋問題。很多文獻(xiàn)中顯示，導(dǎo)致醬油脹袋的微生物是酵母菌，也有文獻(xiàn)指出是乳酸菌和芽孢桿菌［5-6］，可見導(dǎo)致醬油脹袋的微生物不盡相同。本文利用細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基對產(chǎn)自浙江紹興地區(qū)的脹袋醬油進(jìn)行微生物分離，通過產(chǎn)氣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)找到導(dǎo)致醬油脹袋的微生物，然后再對該微生物進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

浙江紹興某廠提供的脹袋醬油、正常醬油、未調(diào)配醬油(原油)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水 1 L，pH7.2 ～7.4，121℃滅菌 20 min。用于分離和保存細(xì)菌。

1.2.2 MRS 培養(yǎng)基［7］

蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母浸膏5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐溫 80 1.0 g，K2HPO42.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Mn-SO4·4H2O 0.05 g，CaCO310.0g，蒸餾水 1 L，pH 6.0～6.5。用于分離和保存乳酸菌。

1.2.3 高糖培養(yǎng)基［3］

酵母粉 10.0 g，葡萄糖500～600.0 g，NaCl 5.0 g，氯霉素 0.1 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。用于分離酵母菌。

1.2.4 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基

每升蒸餾水中含馬鈴薯(去皮切塊)300.0 g，葡萄糖20.0 g，氯霉素0.1 g，瓊脂20.0 g，將馬鈴薯去皮切塊，加1 000 mL蒸餾水，水煮10～20 min，用紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌15～20 min。用于分離霉菌和保存霉菌、酵母菌。

1.2.5 產(chǎn)氣驗(yàn)證培養(yǎng)基

醬油原油50 mL，蒸餾水50 mL，pH 5.5，加入杜氏管，115℃滅菌20 min。

1.3 主要儀器和設(shè)備

AR-2140電子分析天平，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Nikon E100生物顯微鏡，上海澤途機(jī)電設(shè)備有限公司;YXQ-LS-SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;pHS-3C型酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺和GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.4.1 微生物的分離與純化

根據(jù)文獻(xiàn)，脹袋醬油中的菌落總數(shù) ＜102CFU/mL［5］，在分離微生物時只需要做到 10-1稀釋度。無菌條件下，將脹袋醬油樣品充分混勻后，吸取10 mL于90 mL無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖5 min制成菌懸液，稀釋成100、10-1兩個濃度梯度。在無菌條件下準(zhǔn)確吸取不同濃度的菌液0.1 mL，分別加入裝有不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻［8］。每個稀釋度做3個平行實(shí)驗(yàn)，并做空白對照。MRS培養(yǎng)基用無菌封口膜封培養(yǎng)皿，以制造無菌環(huán)境。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24 h;酵母菌在28℃培養(yǎng)3～4 d;霉菌在28℃培養(yǎng)5～7 d。

觀察結(jié)果，將菌落形態(tài)不同的菌種分離，各自傳代培養(yǎng)，至少進(jìn)行3次傳代分離，得到純化菌種，標(biāo)上記號，斜面保存菌種備用［9］。

1.4.2 產(chǎn)氣微生物的驗(yàn)證

將已編號微生物接種到分離用培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，按相應(yīng)條件培養(yǎng)1～2 d制備菌懸液;在無菌條件下用移液槍吸取一定量的菌懸液，加到滅菌后的產(chǎn)氣驗(yàn)證培養(yǎng)基的試管中，使溶液中菌濃度為106～107CFU/mL;每種菌3個平行，用接入無菌生理鹽水做空白對照［10］。細(xì)菌37℃，霉菌和酵母菌28℃恒溫培養(yǎng)7～14 d，觀察小導(dǎo)管中是否有氣泡;若有氣泡則為產(chǎn)氣微生物。同時，用脹袋醬油作為對照，來檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，無菌條件下吸取1 mL醬油加到裝有小導(dǎo)管的5 mL產(chǎn)氣培養(yǎng)基試管中，37℃恒溫培養(yǎng)7～14 d觀察結(jié)果。

1.4.3 產(chǎn)氣微生物的鑒定

細(xì)菌通過觀察菌落特征、菌體形態(tài)與大小以及革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動特性等，并做對溫度、pH、NaCl的耐受性、丙二酸鹽利用等生理特性實(shí)驗(yàn)以及需氧性、明膠液化、淀粉水解、V-P、糖發(fā)酵等生化特性實(shí)驗(yàn)［8，11-13］。酵母菌則通過觀察菌落特征，染色實(shí)驗(yàn)，生理生化實(shí)驗(yàn)確定其種屬;霉菌主要進(jìn)行菌落形態(tài)和菌體特征觀察［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離、純化、產(chǎn)氣驗(yàn)證結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)沒有分離出酵母菌和霉菌及乳酸菌，但利用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離出了細(xì)菌，根據(jù)分離結(jié)果，選擇醬油稀釋梯度為10-1的培養(yǎng)皿來分離、純化細(xì)菌，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離細(xì)菌的結(jié)果見圖1。根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)以及用顯微鏡觀察的菌體形態(tài)的不同，共分離、純化出7 株細(xì)菌，編號為:k1、k2、k3、k4、k5、k6、k7;同時，對7株細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)氣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

圖1 稀釋梯度分別為100和10-1Fig.1 Dilutions of 100and 10-1

醬油稀釋梯度為100時分離細(xì)菌，菌落數(shù)太多、又很密集、相互黏連，好多菌落的形態(tài)相似，不適合用來分離菌株。稀釋梯度為10-1時分離細(xì)菌，菌落數(shù)有36個，數(shù)目適中，且分散，適合分離菌株;其中23個菌落的形態(tài)都十分相似，通過顯微鏡觀察菌體形態(tài)也極其相似，故判斷極有可能是同一種細(xì)菌，且為醬油中細(xì)菌的優(yōu)勢菌。在10-1稀釋度下，根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)以及顯微鏡觀察菌體形態(tài)的不同，共分離、純化出 7 株細(xì)菌菌株，編號 k1、k2、k3、k4、k5、k6、k7，并于4℃冰箱中用營養(yǎng)瓊脂斜面保藏備用。

表1 產(chǎn)氣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Gas production verification results

根據(jù)表1可以看出，接種脹袋醬油樣品的3支試管在7天后均產(chǎn)氣顯現(xiàn)已明顯，在14天后均有嚴(yán)重的產(chǎn)氣現(xiàn)象;空白對照試管在14天內(nèi)均未出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象，說明了結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。k1、k3、k4、k5、k6、k7這6株細(xì)菌在14天內(nèi)沒有一個試管出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象，k2菌株的1根試管在7天后有微弱的產(chǎn)氣，在14 d后3管試管均有明顯的產(chǎn)氣;由此看出，k2菌株在醬油是產(chǎn)氣的。k2菌株產(chǎn)生的氣泡體積和脹袋醬油的相比比較小，這可能是由于k2菌株對產(chǎn)氣培養(yǎng)的環(huán)境有一個適應(yīng)階段，而已脹袋醬油微生物種類多，多種微生物間存在著各種相互作用使得適應(yīng)能力稍微強(qiáng)。但總的來說，k2菌株是導(dǎo)致醬油脹袋的一種微生物，k2菌株在產(chǎn)氣培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣現(xiàn)象如圖2所示。

圖2 k2菌株的產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The gas production results of k2strain

2.2 產(chǎn)氣微生物的鑒定

由以上可知，產(chǎn)氣微生物k2菌株是細(xì)菌，根據(jù)細(xì)菌傳統(tǒng)的鑒定方法來鑒定k2菌株。

2.2.1 形態(tài)觀察

觀察k2菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)上的菌落形態(tài)、個體形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動性觀察，染色結(jié)果見圖3。

圖3 k2菌株的革蘭氏染色和芽孢染色Fig.3 Gram and spore staining of k2strain

2.2.2 生理特性

耐溫、耐酸堿、耐鹽特性，丙二酸利用、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 k2菌株生理特性Table 2 Physiological properties of k2strain

2.2.3 生化特性

生化特性:過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，甲基紅實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)，淀粉水解實(shí)驗(yàn)，糖、醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，需氧實(shí)驗(yàn)等。對于糖、醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，選用液體培養(yǎng)基并在里面加入杜氏小導(dǎo)管觀察是否產(chǎn)氣，結(jié)果見表3。

表3 k2菌株生化特性Table 3 Biochemical properties of k2strain

k2菌株的菌落直徑為1～2 mm，不規(guī)則圓形，邊緣不整齊，中間有凸起，質(zhì)地表面干燥底層濕潤，菌落顏色為灰白色，無光澤，不透明，成菌苔。在液體培養(yǎng)基中有完整菌膜、色暗、褶皺、輕度渾濁或不渾濁。

由圖3可以看出，k2菌株為革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌體呈橢圓形，菌體長度為 3～5μm，直徑 ＞0.1μm，芽孢中生，芽孢為圓形，芽孢囊不膨大;不運(yùn)動。

由生理特性可知，k2菌株具有很強(qiáng)的生存活力。在低溫10℃和高溫45℃都有生長，但是在10℃及以下長勢較弱，k2菌株有很強(qiáng)的耐高溫的能力但是耐低溫能力差，可以考慮將醬油進(jìn)行冷藏。實(shí)驗(yàn)測得k2菌株在含10%鹽分的培養(yǎng)基中長勢已經(jīng)較弱，在14%的鹽分中已經(jīng)不能生長，但醬油的含鹽量一般在16%～19%，可能醬油含有的多種成分間的相互作用使得k2菌株也能在此環(huán)境下生長，所以在考慮抑菌時要考慮到醬油中的環(huán)境，才能確保抑菌效果。

糖、醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)用的是液體培養(yǎng)基里面有放置小導(dǎo)管，只有發(fā)酵葡萄糖的時候出現(xiàn)了微弱的產(chǎn)氣現(xiàn)象，其他糖、醇類均未有產(chǎn)氣現(xiàn)象。由以上形態(tài)觀察和生理、生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，k2菌株為革蘭氏陽性芽孢桿菌，菌體橢圓，芽孢中生、圓形，發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸，V-P反應(yīng)陰性，吲哚反應(yīng)陽性等特性;根據(jù)以上特性，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12-13］鑒定k2菌株為巨大芽孢桿菌。

本文所研究的醬油樣品采用低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝，將沉淀過濾后的原油進(jìn)行調(diào)配(山梨酸鉀1 g/L)，調(diào)配好后經(jīng)過超高溫瞬時滅菌(121～125℃滅菌5 s，出口溫度60℃)，滅菌后經(jīng)水平葉片式過濾機(jī)過濾后泵入成品罐澄清，經(jīng)管道將成品罐中的醬油打入灌裝間，罐裝到已經(jīng)消毒過的包裝袋內(nèi)，常溫貯存1年;春夏季一般在貨架期1個月內(nèi)出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象。酵母菌和霉菌耐熱性差一般的殺菌方法就能將其殺死，芽孢桿菌要121℃滅菌25 min才能將其殺死，因此，在此滅菌條件下，芽孢桿菌很容易殘留在醬油中，在成品罐內(nèi)貯存的過程中極有可能二次生長。另外，儲罐、管道、灌裝間環(huán)境等衛(wèi)生條件控制不好也有可能使產(chǎn)品遭受二次污染。

也有文獻(xiàn)指出在醬油中分離出了巨大芽孢桿菌［15］，但是其并未證實(shí)該細(xì)菌能在醬油中產(chǎn)氣。巨大芽孢桿菌在環(huán)境中是十分常見的，雖不是致病菌，但醬油中含有多種糖、醇類物質(zhì)如葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、麥芽三糖、甘油、D-阿拉伯醇、D-甘露醇等［16］，其生化特性顯示該菌能發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸，若是殘存在醬油產(chǎn)品中，遇到適宜的條件便生長繁殖產(chǎn)氣，在春末、夏季氣溫較高時就會出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象;該菌為醬油生產(chǎn)的有害菌，必須嚴(yán)格控制。成品醬油的普通滅菌方法很難將其殺死，可以通過其他方式來輔助殺菌，有研究指出防腐劑山梨酸鉀和乳酸鏈球菌屬在酸性條件下對芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，比山梨酸鉀更廣譜、經(jīng)濟(jì)的防腐劑尼泊金酯中的尼泊金丙酯鈉只需要0.15 g/kg添加量就能很好抑制醬油中細(xì)菌的生長［17-18］，防腐劑經(jīng)高溫滅菌后會降低其效能，可以考慮滅菌后添加;另外，對于工廠的生產(chǎn)環(huán)境以及設(shè)備等進(jìn)行良好的管理，避免進(jìn)行二次污染，采用熱灌裝，出廠前的短時間的熱水浴也能有效減緩脹袋［2］。

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)自浙江紹興地區(qū)的脹袋醬油為研究材料，利用高糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)、MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基分離其中的酵母菌、細(xì)菌、乳酸菌、霉菌。結(jié)果沒有分離出酵母菌、霉菌以及乳酸菌;用營養(yǎng)瓊脂分離、純化出編號為k1～k77株細(xì)菌。

(2)經(jīng)產(chǎn)氣驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)k2菌株能在醬油中產(chǎn)氣，經(jīng)菌落特征和形態(tài)的觀察、革蘭氏染色和芽孢染色以及系統(tǒng)的生理生化實(shí)驗(yàn)，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定k2菌株為巨大芽孢桿菌。k2菌株為革蘭氏陽性細(xì)菌，在NaCl含量0～10%、培養(yǎng)基pH4.5～9.5及培養(yǎng)溫度10～45℃均能生長，并能發(fā)酵葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖等多種糖產(chǎn)酸。

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