紅霉素對生物膜內銅綠假單胞菌藥敏的影響＊

西電集團醫院（西安710077） 孫安志 溫紅俠 王曉輝

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P．a）是有引起有基礎病變患者社區獲得性感染和醫院獲得性感染的重要條件致病菌。由于P．a易形成生物被膜（Biofilm，BF），因此該感染具有一定的難治性，且易轉化為慢性感染，并對危重患者造成了一定的生命威脅。已有多項資料研究證明14、15元環大環內酯類抗生素如紅霉素、阿奇霉素等可以抑制和破壞P．a BF的作用，阿奇霉素與其他有抗銅綠假單胞菌活性抗生素有協同作用。但亦有報道由于阿奇霉素的廣泛使用，導致多重耐藥菌株的產生［1］。但對紅霉素（Erythromycin，EM）長期作用后BF內P．a的藥物敏感性實驗尚未見報道，因此本研究對EM在抑制BF形成的同時，是否影響BF內P．a藥物敏感性進行探討。

材料和方法

1 實驗材料

1．1 將聚氯乙烯氣管導管（上海景年醫療器械有限公司）制成1cm×1cm，經環氧乙烷滅菌備用。

1．2 菌株：PAO1由丹麥哥本哈根大學臨床微生物科提供。質控菌株為P．a ATCC 27853，由廣西醫科大學一附院臨床實驗中心細菌室提供。

1．3 主要試劑：EM 標準粉劑（批號：130307－200215）均購自中國藥品生物制品檢驗所。LB培養基和戊二醛（Sigma公司）。

2 研究方法

2．1 采用試管二倍稀釋法測定EM對實驗菌的最 低 抑 菌 濃 度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）：平行測定質控菌株ATCC 27853的 MIC作質量控制。

2．2 P．aBF模型的建立：采用文獻［2］方法并改良。將培養過夜的PA01，調至0．5麥氏單位，再用生理鹽水1∶200稀釋，每試管加入5ml，每管置入滅菌BF載體1片，37℃培養24h后換液，以后每48h用50%LB換液。

2．3 抑制P．a生物膜形成實驗：分為空白對照組、EM組。開始建模時，加入藥物EM（1／8MIC）。于建模第7d采用連續稀釋法［2］法行活菌計數，并于第3d、第7d行生物膜半定量測定，每組2個標本，每次測定均重復測定3次取平均值，另取分別1個標本行SEM觀察，以上實驗均獨立重復3次。

2．4 BF細菌藥敏實驗：分別于建模3d和7d，生理鹽水沖洗去掉載體表面浮游菌，載體置于2ml生理鹽水，漩渦震蕩，取生物膜細菌，然后參照［3］采用Kirby－Bauer（K－B）紙片擴散法行阿米卡星、美羅培南、哌拉西林、哌拉西林三唑坦、慶大霉素、舒普深、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環丙沙星、頭孢他啶和氨曲南11種抗生素藥敏實驗。

2．5 SEM觀察BF形成：滅菌生理鹽水沖洗去掉浮游菌后用2．5%戊二醛固定，pH7．4的PBS漂洗3次，依次用50%、70%、80%、90%、100%酒精脫水，真空條件下鍍金粉，SEM觀察。

2．6 統計學方法：采用SPSS13．0，藥物抑制P．a形成BF作用的細菌數和各藥物組內不同作用時間的細菌存活數比較用單因素方差分析；P．a早期或成熟BF經藥物作用后BF內細菌存活數比較用重復測量數據方差分析。

結 果

1 MIC EM 對P．a實驗菌株及質控菌株ATCC 27853的 MIC均為128μg／ml。

2 抑制P．a BF形成實驗

2．1 建模3d實驗結果：SEM觀察觀察，空白對照組可見均勻、密布堆積的稀薄生物膜，可見細菌輪廓及細菌間黏液樣物質。EM組可見散在的早期BF，分布較空白對照組稀疏。EM組載體表面生物膜半定量和空白對照組比較，經統計學分析，差異有顯著性意義（P＜0．01）。提示EM組載體表面形成的生物膜少于空白對照組。

2．2 建模7d后實驗結果：SEM觀察，空白對照組載體表面可見濃厚黏液樣物質，菌體輪廓模糊不清，BF呈立體結構，而EM組僅見稀少的薄層生物膜。載體表面活菌計數結果顯示EM組低于空白對照組（P＜0．01）。載體表面生物膜半定量檢測發現，EM組和空白對照組比較，經統計學分析，差異有顯著性（P＜0．01），提示EM組載體表面生物膜少于空白對照組。

3 EM對BF內細菌藥敏影響的實驗結果 經EM作用后，對所檢測的抗生素均敏感，但和空白對照組比較，對于早期BF細菌，環丙沙星抑菌圈增大（P＜0．05），頭孢他啶和氨曲南抑菌圈亦增大（P＜0．01），見表1。對于晚期BF細菌，頭孢吡肟、環丙沙星和左氧氟沙星抑菌圈直徑明顯小于空白對照組（P＜0．01），而頭孢他啶組明顯增大（P＜0．05），見表2。

表1 紅霉素干預3d后生物膜細菌的藥敏實驗結果（±s）

表1 紅霉素干預3d后生物膜細菌的藥敏實驗結果（±s）

注：△與空白對照組比較，P＜0．01，＊與空白對照組比較，P＜0．05

空白對照組（mm） 紅霉素組（mm）27．0±0．5 27．8±0．4美羅培南 27．1±0．6 27．3±0．7哌拉西林 29．1±0．8 28．9±0．6哌拉西林三唑坦 28．2±0．4 28．2±0．4慶大霉素 25．3±0．5 26．4±0．8舒普深 26．3±1．1 25．6±0．5頭孢吡肟 28．7±0．5 29．2±1．0左氧氟沙星 25．1±0．3 25．7±1．1環丙沙星 31．9±0．3 33．1±1．1＊頭孢他啶 27．4±0．5 28．3±0．5△氨曲南 24．3±0．5 26±0阿米卡星△

表2 紅霉素干預7d后生物膜細菌的藥敏實驗結果（±s）

表2 紅霉素干預7d后生物膜細菌的藥敏實驗結果（±s）

注：△與空白對照組比較，P＜0．01，＊與空白對照組比較，P＜0．05

空白對照組（mm） 紅霉素組（mm）27．3±0．9 27．6±2．6氨曲南 24．2±0．2 26．3±2．6美羅培南 26．7±0．1 26．2±2．0哌拉西林 28．6±1．9 29．4±1．0哌拉西林三唑坦 28．3±1．6 29．6±1．0慶大霉素 25．9±0．8 27．3±2．4舒普深 26．6±0．9 26．8±1．6頭孢吡肟 28．2±0．7 23．8±0．7△頭孢他啶 27．6±1．1 28．9±0．8＊環丙沙星 31．6±0．9 26．5±1．1△左氧氟沙星 24．6±1．0 18．8±1．2阿米卡星△

討 論

BF是細菌為適應自然環境、有利于生存而特有的生命現象，系指細菌吸附于惰性物體如生物醫學材料或機體黏膜表面后，分泌多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復合物，形成網狀立體結構，使細菌相互粘連并將其自身克隆聚集纏繞其中形成的膜樣物。BF的形成和發展大致經歷了粘附期、種殖期、生長期、成熟期、播散期幾個時期。成熟的P．a生物膜由蘑菇樣或柱樣亞單位組成，每個亞單位又互相交錯成網狀，菌體之間互相粘連附著于網狀結構的表面，外層系碳氫化合物被膜。P．a生物被膜這種特殊結構，堅實、穩定，作為一保護屏障，不易被破壞，保護細菌避免與抗生素和免疫攻擊物接觸。有報道［4］顯示，由于細菌生物膜的立體結構，形成一定的滲透屏障，延緩了抗生素對BF的滲透。

目前研究顯示十四（EM、羅紅霉素、克拉酶素）、十五元環（阿奇霉素）的大環內酯抗生素能抑制藻酸鹽合成的關鍵酶－GMD的活性，顯著減少藻酸鹽的合成，抑制BF的形成，臨床實踐也證實［5］：低劑量紅霉素能改善支氣管擴張并銅綠簡單胞菌生物膜感染患者肺功能的急性加重的次數，但可能增加對大環內酯類抗生素的耐藥性。但是對于其他抗生素的敏感性尚無報道。

本研究顯示，在EM作用3d時，SEM觀察發現載體表面僅形成散在、稀疏的早期BF，而空白對照組可見均勻、密布堆積的稀薄生物膜，可見細菌輪廓及細菌間黏液樣物質。BF半定量測定發現，EM組明顯少于空白對照組。EM作用7d后，EM組載體表面僅見稀少的薄層生物膜，而空白對照組載體表面可見濃厚黏液樣物質，菌體輪廓模糊不清，BF呈立體結構。載體表面活菌計數結果顯示EM組低于空白對照組。載體表面生物膜半定量檢測發現，EM組載體表面生物膜少于空白對照組。以上研究結果顯示，1／8MICEM可以抑制P．a生物膜的形成。

另有多項研究顯示［6，7］，亞抑菌濃度抗生素長期連續作用于P．a后，可誘發細菌耐藥和交叉耐藥產生。但是，目前尚未見到，關于長期連續使用亞抑菌濃度的EM對BF內P．a抗生素敏感性影響的相關報道。因此本實驗就1／8MICEM連續作用3d和7d，在抑制P．a生物膜形成同時，是否會影響頭孢他啶、左氧氟沙星、環丙沙星和氨曲南等11種抗生素對BF內P．a的敏感度進行探討。

結果發現，根據參考文獻［3］，不論是早期還是晚期BF，空白對照組P．a對所檢測的抗生素均敏感。單獨應用敏感抗生素并不能完全清除BF內P．a，但是和能破壞BF的EM聯合使用后，卻產生良好的協同殺菌作用，該結果提示，BF對抗生素的滲透限制在細菌耐藥方面有著重要的作用。

EM作用3d后，和空白對照組比較，對于早期BF細菌，環丙沙星抑菌圈直徑增大，頭孢他啶和氨曲南抑菌圈直徑亦增大，其他抗生素抑菌圈直徑大小無差異。但隨著EM連續作用時間延長至7d時，盡管頭孢吡肟、環丙沙星和左氧氟沙星依然對P．a敏感，但是所形成的抑菌圈直徑卻明顯小于空白對照組。同時觀察不同藥物作用時間點的結果發現，其中環丙沙星抑菌圈直徑由EM作用3d時的33．1±1．1mm，降低至作用7d時的26．5±1．1mm，左氧氟沙星抑菌圈直徑由EM作用3d時的25．7±1．1mm，降低至作用7d時的18．8±1．2mm，頭孢吡肟抑菌圈直徑由EM作用3d時的29．2±1．0mm，降低至作用7d時的23．8±0．7mm。提示隨著1／8MICEM作用時間的延長，環丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟對P．a的敏感性呈下降趨勢，并且以左氧氟沙星顯著，甚至臨近敏感標準（18mm）。但是頭孢他啶抑菌圈直徑較空白對照組明顯增大，觀察EM作用不同時間點抑菌圈的大小發現，頭孢他啶抑菌圈直徑由EM作用3d時的28．3±0．5mm，增大至作用7d時的28．9±0．8mm，盡管兩組間差異無統計學意義，但仍有一定的增大趨勢。

經分析以上結果顯示，亞抑菌濃度EM可以抑制早期和晚期P．a生物膜形成的同時，隨著藥物作用時間的延長，EM使頭孢他啶對P．a的抑菌圈有增大趨勢，但卻使環丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟對P．a的敏感性呈下降趨勢，并且以左氧氟沙星顯著，甚至臨近敏感標準（18mm）。

［1］ Lutz L，Pereira DC，Paiva RM，et al．Macrolides decrease the minimal inhibitory concentration of anti－pseudomonal agents againstPseudomonas aeruginosa from cystic fibrosis patients in biofilm［J］．BMC Microbiol，2012 ，8（12）：196．

［2］ Dong YH，Wang LH，Xu JL，et al．Quenching quorumsensing dependent bacterial infection by an N－acyl homoserine lactonase［J］．Nature，2001，411：813－817．

［3］ Brooun A，Uu SH，Lewis K．A dose－response study of antibiotic in Pseudomonas aeruginoda biofilms［J］．Antimicrob A．Gents Chemother，2000，44：640－646．

［4］ Wlters MC，Roe F，Bugnicout A，et al．Contributions of antibiotic penetration，oxygen limitation，and low metabolic activity to toleran ce of Pseudomonas aeruginosa biofilms to ciprofloxacin and tobramycin［J］．Antimicrob A－gents Chemother，2003，47：317－323．

［5］ Serisier DJ，Martin ML，Mc Guckin MA ，et al．Effect of long－term，low－dose erythromycin on pulmonary exacerbations among patients with non－cystic fibrosis bronchiectasis：the BLESS randomized controlled trial［J］．JAMA，2013，309（12）：1260－1267．

［6］ 楊敬芳，郭 進．環丙沙星次抑菌濃度誘導銅綠假單胞菌耐藥的實驗研究［J］．中國藥師，2002，5（1）：11－13．

［7］ 陳 瑞，唐英春，朱家馨，等．亞抑菌濃度亞胺培南體外誘導銅綠假單胞菌耐藥［J］．中華醫院感染學雜志，2005，15（2）：131－133．