人臍帶間充質干細胞修復大鼠坐骨神經損傷的實驗模型研究

延安大學醫學院（延安716000） 韓繼明 楊 玲 王 璐 朱文俠 阮彩蓮

目前臨床上長距離的神經缺損修復一般采用自體神經橋接術，但自體神經的來源有限，因此取材方便、無排斥反應的神經便成為外周神經修復研究的熱點。近年來具有多向分化潛能的人臍帶間充質干細胞（Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cells，HUMSC）受到學者的關注，體外實驗證實其可以分化為神經細胞［1］。筆者對坐骨神經缺損套管模型鼠注入HUMSC懸液，大鼠坐骨神經損傷得到一定程度的修復，現報告如下。

材料和方法

1 材料選擇 60只成年健康SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g。人羊膜取自健康、足月、順產的胎兒胎盤。使用DF12培養基培養純化的HUMSC，傳代過程中使用胰蛋白酶消化。使用日本光電MEB－9200K誘發電位／肌電圖測量系統檢測神經電生理活動。

2 方 法

2．1 人羊膜的制備：超凈臺內從胎盤上分離出羊膜，用0．1%NH4OH處理羊膜后剪成2．0cm×2．5cm小塊，放入500ml無菌PBS中，－20℃儲存備用。室溫融化后使用。

2．2 人臍帶間充質干細胞純化傳代培養：純化的HUMSC傳代過程：PBS清洗，加胰蛋白酶消化2～3min，加培養基終止消化，1000r／min離心4min，加培養基重懸，傳至新的培養液。傳代至3～4代后，配制1×106個細胞／ml的細胞懸液備用［2］。

2．3 坐骨神經缺損套管模型鼠的制備和處理：所有大鼠經烏拉坦麻醉后，對預手術部位進行消毒。股后部作斜行25mm的切口，鈍性分離，暴露、游離坐骨神經，將制備好的羊膜于梨狀肌下緣5mm處搭在坐骨神經上，縫合兩端神經外膜和羊膜，切除6～8mm的坐骨神經，使其自然回縮后達10mm的間隙即可。間隙和羊膜形成一段羊膜腔。60只坐骨神經缺損套管模型鼠隨機分為三組：空白對照組、實驗組、標準對照組。A組大鼠不采取其他措施，B組大鼠羊膜腔內注入HUMSC懸液，C組大鼠實施自體坐骨神經橋接術。觀察記錄大鼠一般的身體狀態。12周后，使用日本光電MEB－9200K誘發電位／肌電圖測量系統檢測神經電生理活動；取雙側腓腸肌，使用分析天平對其濕重進行稱量［3］。

3 統計學方法 所有數據錄入SPSS 17．0軟件中處理，使用±s表示計量資料，t檢驗進行組間比較，P＜0．05表示有統計學意義。

結 果

術后12周兩組大鼠神經電生理檢測結果見表1、2。

表1 12周后各組大鼠腓腸肌濕重比較（±s）

表1 12周后各組大鼠腓腸肌濕重比較（±s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0．05

組 別 術側濕重（g） 健側濕重（g） 術側濕重／健側濕重（%）A組0．37±0．04 1．58±0．08 29．20±0．46 B組 0．40±0．03 1．61±0．06 43．86±0．51＊C組 0．53±0．06 1．62±0．06 55．64±0．42＊

表2 12周后兩組大鼠神經電生理檢測結果（±s）

表2 12周后兩組大鼠神經電生理檢測結果（±s）

注：與標準對照組比較，＊P＜0．05

組 別 潛伏期（ms） 傳導速度（m／s） 波幅（mV）2．56±0．40 12．38±0．38 4．01±0．32 C組 2．49±0．51 13．72±0．41 4．25±0．43 P值 ＞0．05 ＞0．05 ＞B組0．05

討 論

HUMSC能進行多向分化，增值能力強。分娩后的新鮮人臍帶內含有大量的HUMSC，取材方便，不存在倫理和法律的約束；HUMSC不引起排斥反應，主要是因為其對 HLA－DR、CD80、CD40不表達，無 HLA抗原，不能引起T細胞活化［4］。新鮮的胎盤在母體內有胎盤屏障的保護，細菌、病毒污染的概率極低。同時高增殖性、低免疫原性等特點使HUMSC成為治療外周神經損傷替代療法的研究熱點［5］。

本研究中使用人羊膜構建的羊膜腔含有多種可以促進損傷的細胞再生和HUMSC轉化為神經細胞的物質。羊膜內含有大量的糖蛋白和硫酸乙酞肝素等，無細胞成分，自身免疫性很低。其含有的多種物質為再生的神經軸索提供基架，引導神經生長［6］。

實驗中各組大鼠術后術側腓腸肌都出現不同程度的萎縮，是因為神經受損后，肌肉生長依賴的神經末梢釋放的某些營養物質分泌缺乏。B組和C組大鼠的術側濕重／健側濕重比值和A組比較，具有統計學意義（P＜0．05），實驗組的各神經電生理指標和標準對照組比較，潛伏期長，傳導速度慢，波幅小，但無統計學差異（P＞0．05），說明HUMSC抑制了肌肉萎縮，促進神經細胞再生，分化為神經細胞使神經電生理得到恢復。神經傳導性的有無是評價神經功能的一項關鍵指標，傳導速度的快慢、波幅的大小可以輔助判斷神經恢復的程度［7］。

HUMSC修復大鼠坐骨神經損傷的確切機制還不明了，推測與以下機制有關：①在體內微環境的影響下替代神經元，橋接斷端，使神經恢復功能；②改善神經損傷引起的水腫，炎癥反應；③能促進神經元合成代謝，增加蛋白質的合成；④合成和分泌某些營養因子，促進神經元的生長，防止肌肉萎縮［8］。

［1］ 張彩順，呂 剛，張基仁，等．無細胞神經移植物復合骨髓間充質干細胞修復大鼠坐骨神經缺損［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（28）：5429－5432．

［2］ 單 偉，王長輝，秦書儉，等．人臍帶間充質干細胞修復大鼠坐骨神經損傷的實驗研究［J］．中國醫科大學學報，2011，40（8）：696－698．

［3］ 柳 菁，許 超，宇 麗，等．兩種培養體系條件下人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞的分化［J］．中國組織工程研究，2012，16（41）：7625－7630．

［4］ 張芬熙，洪 艷，梁文妹．人臍帶間充質干細胞的分離培養及超微結構特點研究［J］．貴陽醫學院學報，2013，38（1）：5－9．

［5］ 趙玉金，李瑤琛，賴潔娟，等．大鼠骨髓間充質干細胞體外培養條件的優化及生物學特性［J］．第三軍醫大學學報，2010，32（20）：2163－2167．

［6］ Mi－Ae S，Jong JH，Jung－Woo L，et al．Human umbilical cord blood－derived mesenchymal stem cells promote regeneration of crush－injured rat sciatic nerves［J］，Neural Regeneration Research，2012，7（26）：2018－2027．

［7］ 易 智，劉時璋，史 軍，等．人源性臍帶間充質干細胞移植治療骨關節炎的實驗研究［J］．陜西醫學雜志，2012，42（10）：1308－1309．

［8］ 劉時璋，凌 鳴，易 智，等．間充質干細胞在兔骨關節炎關節腔內移植的研究［J］．陜西醫學雜志，2013，42（11）：1450－1452．