草蓯蓉多糖提取物誘導人喉癌Hep2細胞凋亡的實驗研究

延安大學附屬醫院耳鼻喉科二病區 （延安716000） 張 軍 張耀明 王正輝 汪 立

腫瘤的發生發展是一個多因素、多步驟和多基因參與的復雜過程。化療是治療腫瘤一種重要的治療手段，然而目前許多化療作用有限。許多化療藥物被發現即攻擊腫瘤細胞，同時損害人體正常細胞及免疫系統。因而目前急需找到一種能夠阻止腫瘤生長并且副作用小的制劑。近些年來，植物提取物由于其潛在的抗瘤性及低毒性已受到學者的關注。草蓯蓉（Boschniakia rossi）又名不老草，為列當科草本植物，近年來文獻報道，草蓯蓉具有清除自由基、抗脂質過氧化、抗腫瘤、抗炎及增強免疫功能等作用。研究發現草蓯蓉多糖提取物（BRP）可激活巨噬細胞活性，并且對老鼠無毒性及致畸性［1，2］。因而BRP可能對腫瘤是一種安全、有效的制劑。本研究首先提取BRP，然后將BRP作用于Hep2細胞來研究其對細胞的作用及相關分子機制。

材料和方法

1 實驗材料與儀器 草蓯蓉購買自藥店；Hep2細胞購自中國科學院上海細胞中心；卵清蛋白（OVA），MTT，脂多糖（LPS），小牛血清（BSA），二甲基亞砜（DMSO）購買自Sigma；RPMI 1640培養基購自Invitrogen；胎牛血清購自四季青公司；pro－caspase－3，pro－caspase－8，pro－caspase－9，DR5，Bcl－2，Bax，βactin抗體購自Santa Cruz；培養板、培養瓶、培養皿為德國Greiner bio－one公司產品；微孔濾膜為上海亞東核級樹脂有限公司產品；正置、倒置相差顯微鏡及顯微攝影系統（Nikon）；二氧化碳培養箱，FACS Calibur流式細胞儀等。

2 方 法

2．1 多糖制備及分析：將草蓯蓉全草切碎，采用1000ml蒸餾水70～－80度℃過濾，每次3h除去低分子碳水化合物。用等體積乙酸乙酯萃取，取水層。水層繼續用等體積正丁醇萃取，正丁醇層經減壓蒸餾，原始的多糖放置于DEAE纖維素柱，使用蒸餾水洗脫、高濃度氯化鈉濃縮。采用苯硫酸方法在490nm光度下進行低速收集，獲得水溶性成分。水溶性成分使用聚丙烯酰胺葡聚糖200HR層析柱在0．15mmol／L Nacl溶液中，以2ml／min低速進行純化，名為多糖成分（BRP）。對該多糖成分蛋白使用Bradford method進行分析。

2．2 細胞培養：Hep2細胞常規培養于10%FCS RPMI 1640培養基，常規加50U／ml青霉素，50U／ml鏈霉素。置于37℃、CO2培養箱內，每周傳代2次。

2．3 細胞活性測定：Hep2細胞貼壁生長，培養于含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養液中，置37℃、相對濕度5%CO2孵箱內培養。取對數生長期的Hep2細胞按每孔1×105個細胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。待細胞貼壁后，藥物組加入藥物使其終濃度分別為50、100、200μg／ml和400μg／ml，另設不加藥物的陰性對照組以及不接種細胞的空白對照組。分別培養24h，每個濃度每個時點均設4個復孔。于終止前4h，每孔加入5g／L MTT溶液20μl，繼續孵育4 h后棄去上清液，加入150μl DMSO，輕輕振蕩10 min，使結晶物完全溶解，于490nm波長處在酶聯分析儀上測光吸收值（A值），計算生長抑制率［3］。抑制率（%）＝（對照組A值－實驗組A值）／對照組A值×100。

2．4 細胞周期分析：取對數生長期的Hep2細胞按每孔1×106細胞接種于6孔板中，每孔2ml。待細胞貼壁后，藥物組加入藥物使其終濃度為200μg／ml，另設不加藥物的陰性對照組以及不接種細胞的空白對照組。繼續作用細胞24h后，收集細胞懸液。棄掉培養液，70%冷乙醇固定，4℃PI和RNaseA酶暗染30 min，用流式細胞儀對各組樣本進行DNA含量及細胞周期分析。

2．5 流式細胞儀檢測凋亡：取對數生長期的Hep2細胞按每孔1×106細胞接種于6孔板中，細胞密度達到30%～50%時，將不同濃度藥物作用于細胞，培養24h后收集細胞。離心后去除上清液，冰預冷PBS洗細胞2次，保證每管細胞數至少106個。加入5μl Annexin V－FITC和2．5μl PI到另一個試管中，再加入100μl細胞懸液，混勻后室溫孵育10～15min。加入400μl 1×binding buffer混勻后30min內上機。測定每個上機樣管數據，采用Cell Quest軟件進行參數獲取和分析，計算凋亡細胞百分比。

2．6 Western blot檢測相關蛋白：轉染后48h，加入單去污細胞裂解液，在4℃以12000×g離心3min，取上清，用Lowry法定量蛋白，經聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用電轉法將蛋白轉置PVDF膜上，依次加入封閉液、pro－caspase－3，pro－caspase－8，procaspase－9，DR5，Bcl－2，Bax，β－actin抗體、辣根過氧化物酶標記二抗，再經化學發光劑反應，X光片壓片曝光。使用GEL DOC 2000system分析軟件對條帶進行分析。

2．7 統計學方法：以上方法均各取3個樣本，每個樣本重復3次。采用SPSS 10．0軟件包，對實驗數據進行配對tq檢驗和組間方差分析。

結 果

1 BRP化學成分分析 采用乙醇提取法獲得水溶性的粗多糖成分。然后經過DEAE層析柱、Sephacryl S－200HR滲透獲得純化的多糖，高通量色譜分析儀結果發現BRP為單個、尖銳的峰，顯示出提純的BRP單一性。根據分子量檢測顯示BRP大約為22kDa，純度為96．9%。Bradford法檢測結果為陰性，提示BRP內無蛋白及核酸成分。

2 BRP對Hep2細胞活性的影響 與對照組相比，不同濃度的BRP對細胞活性呈時間、濃度依賴性抑制。作用72h后，400μg／ml的BRP對細胞活性抑制率最高達到87．57%，而50μg／ml的BRP在不同時間點對細胞活性抑制率與對照組相比無明顯差異（P＞0．05）。因此后續檢測選用100，200和400μg／ml三個濃度進行檢測，見附表。

附表 MTT法檢測不同濃度BRP對細胞活性的影響

3 BRP對細胞周期的影響 流式細胞儀分析結果顯示，空白對照組細胞G0／G1，S和G2／M期細胞比率分別為22．4%，59．4% 和19．3% 。而200μg／ml BRP作用24h后，G0／G1期細胞比率顯著上升，多數細胞阻滯在G0／G1期，比率達到67．6%。同時伴隨著S期細胞比率達到23．6%。

4 BRP對細胞凋亡的影響 采用annexin－V／PI染色法檢測細胞凋亡，結果發現與對照組相比，不同濃度的BRP（100，200，400μg／ml）作用24h后，各組細胞凋亡比率明顯增加，分別是23．44%，43．86%，53．67%。這些結果提示BRP可能主要通過誘導Hep2細胞凋亡來抑制細胞的生長。

5 凋亡途徑分析 采用 Western blot檢測凋亡相關途徑，結果發現與對照組相比，隨著濃度的增加，BRP 明 顯 抑 制 pro－caspase－3、pro－caspase－8、procaspase－9的表達，說明 pro－caspase－3、pro－caspase－8、pro－caspase－9分裂增加，同時可明顯抑制 Bcl－2的表達。而死亡受體DR5、Bax的表達則明顯增加。

討 論

喉鱗狀細胞癌是人體頭頸部高發和高病死率的腫瘤，占到頭頸部腫瘤的90%左右，其常規治療方法是外科手術和放療。盡管許多研究發現，系統性的化療對鱗癌有效，然而其手術和術后化療5年生存率仍較低［4］。故采用新化療藥物并研究新化療方案，以提高療效、減低化療毒性、增強耐受性成為研究的熱點。

目前研究發現一些傳統的中藥對許多腫瘤包括鱗癌有效，并且毒副作用小。這些中藥主要通過刺激巨噬細胞及調節人體補體系統來抑制腫瘤的生長［5，6］。研究發現草蓯蓉提取物具有多方面的藥理活性，而這多重的藥理作用決定了它的用途。研究發現草蓯蓉提取物具有抗腫瘤和清除自由基作用。王秋燕等研究發現草蓯蓉可抑制小鼠肝癌的生長［7］，并可激活小鼠的免疫系統［8］。因此本研究采用草蓯蓉提取物BRP作用于Hep2細胞，觀察其對細胞的影響，研究發現不同濃度的BRP可明顯抑制細胞的生長，并使細胞周期發生變化，通過流式細胞儀分析發現BRP作用后細胞凋亡明顯增加，說明BRP主要通過誘導細胞凋亡來抑制Hep2細胞的生長。

細胞凋亡的過程是程序化的、多基因調控的。與細胞凋亡相關的基因大致有bcl－2家族、p53、fas、cmyc、k－ras等，細胞是否進入凋亡通道取決于這些凋亡相關基因的綜合調控結果［9］。目前研究發現參與細胞凋亡主要有兩個途徑：外部死亡受體途徑與內部線粒體途徑。兩條途徑交匯于capase基因的激活，而這一基因在誘導過程中起關鍵的調控作用。為了研究BRP誘導Hep2細胞凋亡的分子途徑，本研究采用western blot檢測分析相關蛋白。結果發現不同濃度BRP作用于細胞后，capase－3、capase－8和capase－9的表達呈濃度性增加，而這些蛋白的變化表明外部途徑與線粒體途徑都被激活。而死亡受體DR5表達的增強表明外部途徑的參與。Bcl－2家族是參與細胞生存或凋亡的重要調節蛋白，與線粒體途徑密切相關。其家族成員具備雙重功能，其中Bcl－2、Bcl－xl等抑制細胞凋亡的產生，而Bax、Bcl－xs等促進細胞凋亡。本研究發現BRP作用后Bcl－2表達減少，Bax表達增加，這些結果表明BRP激活Hep2細胞線粒體凋亡途徑主要通過激活Bcl－2家族來實現。

通過實驗我們發現草蓯蓉多糖提取物BRP通過使細胞周期變化，誘導細胞凋亡可明顯抑制人喉癌Hep2細胞的增殖，其凋亡機制為外部死亡受體和內部線粒體途徑共同參與凋亡的發生。這些為研制新的化療藥物提供實驗依據，深入研究BRP對喉癌細胞的作用機制可能為治療鱗癌或其它腫瘤提供新的思路。

［1］ Fei R，Chi LC，Du JS，et al ．Toxicity of polysaccharides of Boschniakia rossica［J］．Northeast Normal Univ，2008，40：98－100．

［2］ Chihara G．Recent progress in immunopharmacology and therapeutic effects of polysaccharides［J］．Dev Biol Stand，1992，77：191－197．

［3］ 李發萍，曹 華，吳玉瑛，RNA干擾Jab1基因對人喉鱗狀細胞癌Hep2細胞增殖影響［J］．中國耳鼻咽喉頭頸外科，2011，18（9）：465－468．

［4］ 張健梅，文 姝，李 杰，等．三氧化二砷與紫杉醇聯合誘導Hep2細胞凋亡的體外研究［J］．中國耳鼻咽喉頭頸外科，2011，18（4）：196－199．

［5］ Wang SY，Hsu ML，Hsu HC，et al．The antitumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines released from activated macrophages and T lymphocytes［J］．Int J Cancer，1997，70：699－705．

［6］ Wasser S．Medicinalmushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2003，60：258－274．

［7］ 王秋燕，王 晶，倪 穎，等．草蓯蓉水萃取物對小鼠肝癌移植瘤的生長抑制作用［J］．延邊大學醫學學報，2012，35（2）：107－109．

［8］ 金愛花，樸龍，尹學哲，全吉淑．草蓯蓉環烯醚萜苷對H22小鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用［J］．中草藥，2012，43（2）：332－335．

［9］ Lu QL，Poulsom R，Wong L，et al．Bcl－2expression in adult and embryonic non－haematopoietic tissues［J］．J Pathol，1993，169（4）：431－437．