大黃魚β-actin抗體的制備與組織表達譜分析

董 樂, 姚麗梅, 戴聰杰, 張 樂, 黃蘋蘋, 王建穎

(泉州師范學院 化學與生命科學學院, 近海資源生物技術福建省高校重點實驗室, 福建 泉州 362000)

肌動蛋白(Actin)是構成細胞骨架的主要成分[1],幾乎參與了真核細胞的所有生理過程, 如細胞分裂、染色體運動、細胞器運動、細胞激化、胞質流動、基因轉錄調控、mRNA 加工和運輸等[2-4]。肌動蛋白有6 種異構體, 根據等電點的不同分為α、β、γ 3類:兩個橫紋肌(α-骨骼肌型, α-心肌型), 兩個平滑肌(α-血管平滑肌型, γ-內臟平滑肌型), 兩個細胞質型(β和γ亞型)[5]。其中, β-actin 除具氨基酸序列高度保守性外, 還能在不同的組織中持續衡量的表達, 且其表達量高, 因此在研究某個基因 mRNA及蛋白質的相對表達量時, 常分別采用 β-actin 基因的 mRNA 和β-actin作為內標[6-9]。但近年來也有研究表明, β-actin基因有時也會受到生理狀態或者環境的調控而出現表達水平的差異[10-12]。因此, 在采用 β-actin及其基因作為分子內標開展實驗研究時, 必須首先評價其在該物種中的表達特征。

迄今, 鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、真鯛(Pagrosomus major)、斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、(Elopichthys bambusa)、尖頭(Phoxinus oxycephalusSauvage et Dabry)、團頭魴(Megalobrama amblycephala)、鯉(Cyprinus carpio)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、斜帶石斑魚(Epinephelusco joides)、大西洋鮭(Salmo salar)、羅非魚(Oreo-chromis mossambicus)、松江鱸(Trachidermus fasciatus)等硬骨魚類的 β-actin基因已被克隆[13-14]。大黃魚(Larimichthys crocea)系鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Pseudosciaena), 是中國海洋主要經濟魚類之一[15]。對大黃魚功能基因的挖掘與利用的研究極為重要。大黃魚 β-actin基因(LcActb)全長cDNA序列已被提交GenBank(GU 584189.1;FJ936563.1), 但其在轉錄和翻譯水平上組織表達譜的研究尚未見報道。

本研究采用RT-PCR技術克隆LcActb的開放閱讀框(Open reading frame, ORF), 同時, 將其亞克隆到原核表達載體上進行表達, 并制備和純化抗LcActb的多克隆抗體, 通過實時熒光定量PCR(qRTPCR)和Western blotting方法, 分析LcActb在肌肉、心臟、肝臟等 8 個組織中的表達模式, 為探討其作為內參基因進行相關研究的可行性, 也為進一步研究大黃魚功能基因的差異表達提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟大黃魚 (全長 410~450 mm)活體購于福建省寧德市海洋技術開發有限公司, 解剖后, 取其心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共8 種組織,立即凍存于液氮中, 帶回實驗室后轉入-80℃冰箱保存備用。雌、雄魚各取 5 尾, 用于提取克隆LcActb的ORF序列和分析LcActb組織表達所需的總RNA。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增LcActb的ORF序列

以常規 Trizol 法提取各組織的總 RNA后, 按Invitrogen公司的試劑盒說明書進行 mRNA的純化和cDNA第一鏈的合成。以合成的肝臟cDNA第一鏈為模板, 根據已克隆的LcActb全長 cDNA序列(GenBank accession: GU584189.1; FJ936563.1)設計 1對特異性引物, 以此進行 PCR擴增得到LcActb的ORF序列, 引物序列如下;

P1: 5′- CCCAAGCTT(Hind III識別位點)ATGG AAGATGAAATCGCCGC;

P2: 5′- CCGCTCGAG(XhoI識別位點)TTAGAA GCATTTGCGTTTGCGGTGGAC,

引物由上海生工生物技術工程服務有限公司合成。

PCR 反應體系為 50 μL, 其中包括 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTPs、10-4mmol/L P1、10-4mmol/L P2、1 unit Taq DNA polymerase。反應條件為94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性1 min, 50 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min,循環數35 個; 72 ℃再延伸10 min。

1.2.2LcActb原核表達載體的構建

按文獻[16]進行; DNA測序由上海生工生物技術工程服務有限公司進行;LcActb的 ORF序列分析用DNA Strider 1.2。

1.2.3 pET32a-LcActb在大腸桿菌中的表達及可溶性分析

重組質粒轉化E.coliBL21, 挑取陽性單菌落,活化后進行誘導表達, 同時設未誘導對照。其中,IPTG 分別設置為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mmol/L,誘導溫度分別設置為18、24、28、34、37 ℃, 誘導時間分別設置為 2、3、4、5、6、7 h。重組表達蛋白可溶性分析按文獻[16]進行。用SDS-PAGE電泳檢測表達產物, 分離膠濃度為12%。

1.2.4 LcActb的純化

重組菌按上述探索好的條件大量表達。LcActb的純化按QIAGEN公司Ni-NIA Agarose試劑盒說明書進行, 并用SDS-PAGE 鑒定蛋白純度。

1.2.5 LcActb抗血清的制備及效價檢測

按文獻[17]進行。

1.2.6 LcActb抗血清IgG的純化

按文獻[18]進行。

1.2.7 Western Blotting 分析

按文獻[16]進行。其中, 鼠抗His單克隆抗體作為一抗(1: 3000), 辣根過氧化物酶( HRP) 標記的羊抗鼠IgG 為二抗(1: 4000), 用ECL發光試劑盒曝光充分顯色, 拍片保存。

1.2.8LcActb在大黃魚各組織的表達

分別提取心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共8 種組織的RNA后, 進行qRT- PCR。引物序列如下,

qAct1: ACGCCAACACCGTGCTGTC;

qAct2: TTAGAAGCATTTGCGGTGGAC,

引物由上海生工生物技術工程服務有限公司合成。

qRT- PCR 反應體系為 15 μL: Mix 7.5 μL, qAct1 0.15 μL; qAct2 0.15 μL; cDNA 1.5 μL; RNase Free ddH2O 補至 15 μL。

于 StepOnePlus?實時熒光定量 PCR 系統上擴增, 程序為: 50 ℃ , 2 min; 95 ℃ , 10 min; 95 ℃ , 15 s,60 ℃ , 1 min,循環數40 個。PCR 擴增產物先用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。LcActbmRNA相對表達水平用 2–ΔΔCT法計算[19]。每個樣品重復 3 次。以肝臟的表達水平作對照, 目的基因相對表達量用平均值±標準差表示, 數據分析采用 SPSS17.0統計分析軟件,Duncan法進行多重比較, 當P<0.05 時差異顯著。

1.2.9 LcActb在大黃魚各組織的表達

從心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共 8 種組織中提取總蛋白。采用 Bradford 方法[20]定量蛋白質后, 每個組織取 1 mg 蛋白質進行SDS-PAGE分析, 分離膠濃度為 12%。經 Western Blotting檢測 LcActb 在大黃魚各組織中的表達情況。實驗經3 次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 pET32a-LcActb的構建及鑒定

LcActbORF的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后, 將預期大小的 PCR產物與 pET32a(+)載體用T4DNA 連接酶連接。連接產物轉化E.coliDH5α,經選擇性培養基篩選和雙酶切鑒定, 挑選陽性重組質粒進行測序。測序結果表明(圖1), 該片段長1128 bp,編碼375個氨基酸殘基組成的肽段。序列分析表明, 該片段序列與原序列一致, 閱讀框架正確, 目的基因插入正確, 顯示重組表達載體pET32a-LcActb構建成功。

圖1 LcActb的ORF序列和推斷的氨基酸序列Fig.1 The cDNA and predict amino acid sequences of the LcActb ORF in L.crocea

2.2 LcActb蛋白原核表達、可溶性分析及純化

pET32a-LcActb重組菌經菌落 PCR檢測后, 隨機挑取 1個陽性菌, 加 IPTG 誘導表達。pET32a-LcActb誘導表達量隨溫度升高而增多, 至 28 ℃時,其表達量達最高后, 又隨溫度升高而減少。故選擇誘導溫度為 28 ℃, 結果見圖2A。由于目的蛋白為41.701 ku, 加上質粒 pET-32a(+)在多克隆位點上游有一段編碼序列, 融合蛋白約為45~47 ku。實驗結果與預期的目的蛋白大小相符。不同時間誘導時, 誘導5 h 后誘導表達量增多, 故選擇誘導時間為 5 h, 結果見圖2B; 不同 IPTG 濃度誘導時, IPTG 濃度從0.1 mmol/L 到0.8 mmol/L 誘導時, 表達量最大時的IPTG 濃度為0.4 mmol/L, 結果見圖2C; 用IPTG 濃度為0.4 mmol/L 誘導表達的BL21 重組菌經離心收集菌體, 菌體經超聲波裂解, 用 SDS-PAGE 分析裂解后的上清和沉淀, pET32a-LcActb表達蛋白存在菌體裂解液沉淀中, 即以包涵體形式表達, 結果見圖2D。

純化的LcActb用SDS-PAGE進行分析, 結果只含有一條目的蛋白帶(圖3A)。蛋白濃度為1.67 g/L。經 Western blotting 驗證, 泳道上出現蛋白特異性的反應條帶(圖3B)。實驗結果表明, LcActb表達成功。

2.3 抗LcActb抗血清制備及其效價檢測和特異性分析

以純化LcActb為抗原制備抗血清。以未免疫的兔血清作為陰性對照, 將免疫的兔抗血清做不同稀釋后, 進行 ELISA檢測。標本孔的吸收值與陰性標本孔的吸收值的比值(P/N)大于 2.1時判斷為陽性。結果表明, LcActb的兔抗血清效價達到1 ∶ 1.00×106。

圖2 pET32a-LcActb原核表達條件的優化及可溶性分析SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of optimized expression condition and the protein solubility of pET32a-LcActb in E. coli

圖3 LcActb蛋白純化的 SDS-PAGE圖譜和 Western blotting 驗證Fig.3 SDS-PAGE and Western blotting analysis of purified LcActb

Western blotting結果顯示, 用免疫前的血清進行實驗時不顯示條帶; 未純化的抗血清由于含有很多非特異性抗體, 所以有非特異性條帶; 而用純化的LcActb特異性的抗體(1: 1000 稀釋), 則無非特異性條帶(圖4)。以上結果表明, 制備和純化后的LcActb 多克隆抗體特異性較強。

2.4 LcActb基因在大黃魚各組織的表達

利用qRT- PCR方法分析LcActb在大黃魚心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共8 種組織的表達及差異, 結果顯示,LcActb在這些組織中均有表達。

應用2–ΔΔCT法計算LcActb在各組織中的表達量,以肝的表達量為 1 計算,LcActb在各組織的表達量無顯著性差異(圖5)。

利用Wester blotting 方法分析LcActb在大黃魚上述8 種組織的表達及差異, 結果顯示(圖6), LcActb在這些組織中含量無顯著差異。

圖4 純化的多克隆抗體的Western blotting特異性分析Fig.4 Western blotting analysis of purified LcActb antibody

圖5 LcActb在不同組織中的表達量Fig.5 Expression pattern of LcActb in different tissues of L.crocea

圖6 LcActb在不同組織中的含量Fig.6 Expression pattern of LcActb in different tissues of L.crocea

3 討論

一直以來, 在分子生物學領域的基因 mRNA的相對表達研究中, 由于β-actin具有時空恒定表達的特性而成為最常用的內參基因。但近年來有研究認為,β-actin在有些物種、某些情況下并不適合作為內參基因。其一,β-actin表達水平在不同的外界環境或生理條件下可能存在顯著的差異[20-21], 如廣溫性鯉(Cyprinus carpio)冷適應機制的研究表明,β-actin的表達水平在冬季和夏季存在顯著性差異[22]。其二,β-actin基因的表達水平在生物不同的生長階段也有所不同[23], 如斑馬魚 β-actin基因表達量在腦神經細胞增殖時過表達[24]。其三, β-actin 基因受某些疾病的影響表達量也有所不同, 如在哮喘患者氣道中β-actin基因的表達水平比正常組織中的表達水平低10倍[11]。這說明, 在利用β-actin作為內參進行基因表達研究時, 首先要對其作為分子內參的可靠性進行評估。

本研究通過qRT-PCR 檢測得到的結果表明, 大黃魚LcActb的mRNA 在所采集的成體魚心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共 8種組織中的表達差異均不顯著。這與寬體沙鰍(Botia reevesae)[13]、鳡(Elopichthys bambusa)[14]、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)[25]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[26]中的研究結果基本一致。但迄今, 關于魚類β-actin表達的研究都沒有從不同的發育階段及外界環境或生理條件對其影響等方面進行系統的展開, 基本上僅限于基因在某一時期不同組織中的表達差異方面進行分析。本研究只研究了成體魚不同組織中LcActb的表達情況, 至于,LcActb表達水平在不同的生長階段、在不同的外界環境或生理條件下是否存在差異,將是我們下一步要深入研究的問題。因此,LcActb可作為研究大黃魚成體魚中其他基因表達轉錄水平時的內參標準。

mRNA 的相對量說明了β-actin在轉錄水平是否存在差異; 蛋白質的相對量能進一步表明β-actin在轉錄后水平的差異。現有文獻也基本上只針對于前一個方面開展研究。本研究進一步分析了LcActb在轉錄后的蛋白質水平的差異。Western blotting檢測的結果表明,LcActb在轉錄后水平也無差異, 即LcActb在8 種組織中表達量恒定。因此,LcActb可作為研究大黃魚成體魚中其他基因表達轉錄后水平的內參標準。

[1]Ma H M, Mai K S, LiuFu Z G.Cloning and characterization of an actin gene ofChlamys farreriand the phylogenetic analysis of mollusk actins[J].Chin J Oceanol Limnol, 2007, 25(3): 304-309.

[2]Pederson T.Half a century of “the nuclear matrix” [J].MolBiol Cell, 2000, 11(3): 799-805.

[3]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al.MEGA 4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) softwareversion 4.0[J].Mol Biol Evol, 2007, 24(8): 1596-1599.

[4]Wang Z L, Wu Z H, Jian J C, et al.Cloning and expression of an actin gene in the haemocytes of pearl oyster (Pinctada fucata, Gould 1850) [J].Mar Genom,2008, 1(2): 63-67.

[5]Venkatesh B, Tay B H, Elgar G, et al.Isolation, characterization and evolution of nine pufferfish(Fugu rubripes)actin genes[J].J MolBiol, 1996, 259(4): 655-665.

[6]Zhong H, Jonathan W S.Direct comparison of GAPDH,β-actin, cyclophilin, and 28S rRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia[J].Biochem Biophys Res Commun, 1999, 259(3) : 523-526.

[7]夏來新, 程漢華, 郭一清, 等.黃鱔 β-actin 的克隆及其在魚類中的系統發生分析[J].遺傳學報, 2005,32(7) : 689-695.

[8]Nicot N, Hausman J F, Hoffmann L, et al.Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress[J].J Exp Bot, 2005, 56( 421) : 2907-2914.

[9]Isabel C, Francisco V S, Frederick S B, et al.Isolation of the Atlantic salmon β-actin promoter and its use to drive expression in salmon cells in culture and in transgenic zebrafish[J].Aquaculture, 2010, 309(1-4):75-81.

[10]段晶晶, 李霞, 周伯文, 等.仿刺參 beta-actin 基因的克隆及在各組織中的表達[J].大連水產學院學報,2009, 24(2): 176-180.

[11]Glare E M, Divjak M, Bailey M J, et al.beta-actin and GAPDH house keeping gene expression in asthmatic airways is variable and notsuitable for normalising mRNA levels[J].Thorax, 2002, 57(9): 765-770.

[12]Ruan W J, Lai M D.Actin, a reliable marker of internal control[J].Clin Chim Acta, 2007, 385 (1-2): 1-5.

[13]覃川杰, 陳立僑, 岳興建, 等.寬體沙鰍(Botia reevesae)β-肌動蛋白基因的 cDNA 克隆與表達分析[J].海洋與湖沼, 2013, 44(2): 396-402.

[14]郁建鋒, 王蕾, 張燕萍, 等.鳡 β-肌動蛋白基因的克隆及表達分析[J].常熟理工學院學報(自然科學),2011, 25(4): 65-70.

[15]張彩蘭, 劉家富, 李雅璀, 等.福建省大黃魚養殖現狀分析與對策[J].上海水產大學學報, 2002, 11(1) :77-83.

[16]薩姆布魯克J, 拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M].黃培堂等, 譯.第 3版.北京: 科學出版社, 2002:1217-1232.

[17]楊琴, 曹軍皓, 丁進亞, 等.轉位緊密黏附素受體細胞骨架偶聯蛋白基因克隆、表達、抗體制備及應用[J].細胞與分子免疫學雜志, 2012, 28(12): 1282-1285.

[18]Zhao Q G, Zhou Y, Zhu H Q, et al.Generation of mouse FANCL antibody and analysis of FANCL protein expression profile in mouse tissues[J].Acta Genetica Sin, 2006, 33(1): 49-55.

[19]Livak K J, Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J].Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[20]Bradford M M.A rapid and sensitive method of or the quantitation of microgram quantitative of protein using the principle of protein - dye binding[J].Anal Biochem,1976, 72: 248-254.

[21]梁贊姜, 汲坤, 王立軍.大鼠不同臟器 beta-actin mRNA穩定性差異的實驗研究[J].錦州醫學院學報,2006, 6(3): 11-13.

[22]Sarmiento J, Leal S, Quezada C, et al.Environmental acclimatization of the carp modulates the transcription of beta-actin [J].J Cell Biochem, 2000, 80(2): 223-228.

[23]Moshier J A, Cornell T, Majumdar A P.Expression of protease genes in the gastric mucosa during aging [J].Exp Gerontol, 1993, 28(3): 249-258.

[24]Alejandro B, Rogelio G S, María G I, et al.Differential brain expression of a new beta-actin gene from zebrafish (Danio rerio) [J].Eur J Neurosci, 1999, 11(1):369-372.

[25]袁一鳴, 李家樂, 汪桂玲, 等.三角帆蚌β-肌動蛋白基因的 cDNA 全長克隆及表達分析[J].水產學報,2010, 34(6): 871-879.

[26]宋偉, 王曉琳, 嚴維輝, 等.黃顙魚β-肌動蛋白基因的克隆及表達分析[J].江蘇農業學報, 2008, 24(3):263-267.