有機磷農藥類雌/抗雄激素效應研究進展

王汝平, 王 軍, 孫長青, 汝少國

(1.中國海洋大學 海洋生命學院, 山東 青島 266003; 2.中國海洋大學 環境科學與工程學院, 山東 青島266003)

有機磷農藥是世界范圍內使用最廣、用量最大的高效廣譜殺蟲劑之一[1], 產量占我國農藥總產量的40%以上[2]。農藥的使用量中只有不到 1%能對靶生物起作用, 大部分漂浮在空氣或殘留在土壤中, 并通過降雨、沉降和徑流進入河流湖泊造成水體污染。2010年我國珠江河口流域水體中有機磷農藥檢測濃度范圍為18.76～344.94 ng/L, 其中甲拌磷已接近人類可接受范圍的臨界點[3]。此外, 邕江、桑溝灣海域、廈門近海等[4-6]多個水域均檢出有機磷農藥, 可見有機磷農藥對水環境質量安全和人體健康具有潛在的風險。

近年來的研究表明, 環境背景濃度的有機磷農藥長期暴露, 除了能導致大鼠胰腺[7]和硬骨魚類肝胰臟等[8]發生氧化性損傷外, 還能夠發揮類雌/抗雄激素效應, 擾亂睪酮、雌二醇等激素的分泌, 誘發生殖毒性。例如, 李赟[9]報道了久效磷暴露誘導雄性孔雀魚(Poeciliareticulata)性腺睪酮水平下降, 雌二醇水平升高; 進而導致雄魚交配器長度和精子數均顯著降低, 出現第二性征雌性化, 降低了雄魚的繁殖成功率。在馬拉硫磷、二嗪農對硬骨魚類[10-11]及甲基對硫磷對大鼠[12]的研究中也有類似報道。目前有機磷農藥的類雌激素效應研究較為深入, 而其抗雄激素效應的相關研究還處于起步階段。本文對有機磷農藥的類雌/抗雄激素效應進行了綜述。

1 有機磷農藥的類雌激素效應及其機制

1.1 有機磷農藥類雌激素效應

目前在體內、體外篩選實驗中, 至少10種有機磷農藥表現出類雌激素效應(表1)。有機磷農藥發揮類雌激素效應, 能夠誘導 17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、睪酮(testosterone, T)和 11-酮基睪酮(11- ketotestosterone, 11-KT)等性激素水平失衡, 從而導致生殖毒性, 包括改變第二性征、影響生殖器官功能、降低生殖細胞質量等。研究表明, 15 mg/kg樂果使雄性大鼠睪丸內T水平下降近50%[21]; 甲拌磷(35, 50 mg/kg)暴露30 d導致雄性大鼠睪丸質量減輕, 曲細精管直徑、睪丸內生殖細胞和支持細胞數量均顯著下降[22]。馬拉硫磷能夠顯著抑制雌性黃鱔(Monopterus albus)卵巢芳香化酶活性, 造成 T和 E2水平紊亂[23], 最終導致其卵巢退化[24]。二嗪農[25]對藍鰓太陽魚(Lepomis macrohirus)、久效磷[26]對斑馬魚(Danio rerio)的影響研究也得到了相似的結果。同時, 有機磷農藥還能夠導致雌激素受體(estrogen receptors,ERs)等相關基因表達水平的上調。例如, 樂果暴露能夠誘導雄性大鼠腦、肝臟的ERα、ErβmRNA表達水平極顯著升高[27]。

具有類雌激素效應的有機磷農藥能夠通過擾亂性激素平衡, 導致雄性生殖能力下降; 對于雌性, 則會造成床前胚胎丟失率、自然流產率上升, 對繁殖產生不利影響。Amina 等[28]以樂果(7, 15, 28 mg/(kg·d))染毒雄性小鼠20 d后與雌鼠交配, 結果顯示雄性交配指數、生育指數均顯著降低, 研究認為T水平下降以及貯精囊、前列腺等器官損傷是導致雄性性欲降低、生殖力下降的直接原因。同樣, 二嗪農能夠降低雄性大西洋鮭(Salmo salar)血漿T含量, 抑制雄魚對前列腺素 F2α的反應性, 從而減弱雄性生殖力[29]。28 mg/kg樂果引起著床所依賴的雌激素、孕激素比例失衡, 進而導致小鼠床前胚胎丟失率顯著升高[30]。

表1 發揮類雌激素效應的有機磷農藥

有機磷農藥還能夠通過發揮類雌激素效應影響硬骨魚類的性別分化。魚類的性別決定受多方面的調控, 主要可分為基因型性別決定和環境型性別決定[31]。研究表明, 魚類的性別決定主要受發育的關鍵窗口時期胚胎所處的激素環境影響[32], 因而環境內分泌干擾物自魚類發育早期開始暴露, 能夠在一定程度上影響其性別分化方向。Zhang等[33]以 0.001,0.010 和0.100 mg/L久效磷農藥(40%水溶性制劑)自受精卵起暴露斑馬魚(Danio rerio)至40 dph, 結果發現久效磷農藥能夠導致斑馬魚性比偏雌性化,0.100 mg/L暴露組雌性個體比例高達71%, 這是由于久效磷農藥通過促進卵巢分化相關轉錄因子foxl2基因表達, 并抑制精巢分化相關轉錄因子dmrt1基因表達, 上調性腺芳香化酶表達, 從而直接促進斑馬魚卵巢的分化, 導致其性比向雌性偏離; 久效磷農藥還能夠上調腦芳香化酶基因, 間接通過 HPG軸的調控作用, 進一步導致斑馬魚雌性化。但這方面的研究由于實驗設計、有機磷農藥類型、實驗物種等方面的差異,所得結果不盡一致[34]。例如, Tian等[35]研究報道, 孔雀魚(Poecilia reticulata)自出生至成年暴露于久效磷農藥(0.01, 0.1 mg/L), 性別比例沒有變化, 推測原因在于性別分化的敏感度在不同物種間存在一定差異。

1.2 有機磷農藥類雌激素效應機制

1.2.1 干擾性激素的合成與轉化

性激素的合成轉化過程是在細胞的線粒體和滑面內質網中以膽固醇為底物進行的一系列酶促反應,該過程的主要限速步驟主要有: 需要類固醇激素合成急性調節蛋白(steroidogenicacute regulatory protein,StAR)將合成底物膽固醇從線粒體外膜運送至線粒體內膜的轉運過程; 膽固醇側鏈裂解酶(cholesterol side chain cleavage enzyme, CYP11A1)和 17α羥化酶(cytochrome P45017 alpha-hydroxylase, CYP17)催化膽固醇向T轉化的過程; 性腺芳香化酶P450 (cytochrome P450 aromatase, CYP19A)負責催化T芳構化為E2的過程, 以及 11β-羥化酶催化 T向 11β-羥基睪酮轉化的過程; 最后由 11β-羥類固醇脫氫酶 II(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type II, 11β-HSD2)作用生成 11-KT[36]。研究認為StAR、CYP11A1、CYP17、CYP19A等均可作為環境雌激素發揮作用的主要靶位點[37]。

有機磷農藥可以通過干擾性腺中 StAR活性或StARmRNA表達水平, 影響膽固醇被轉運至線粒體內膜, 導致性激素合成底物的減少, 使性激素合成水平急劇下降或性激素合成途徑中斷; 也可以誘導類固醇生成酶例如 17β-羥類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase, 17β-HSD) 、 P45017α和P450arom等基因表達的上調或下調, 使酶活性的增強或減弱, 最終升高或降低機體的性激素水平, 影響機體正常的生殖功能。例如, 50 μg/mL樂果暴露MA-10小鼠睪丸間質瘤細胞2~4 h, 導致StARmRNA表達水平顯著降低, 從而使進入線粒體內膜的膽固醇含量降低, T合成量顯著下降[38]。Bagchi等[39]證明, 喹硫磷能夠抑制胡鲇(ClariasBatrachus)性激素合成過程中 3β-HSD、17β-羥類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSD)的活性, 從而使雄激素合成過程受阻, 發揮類雌激素效應。本實驗室研究證明, 40%久效磷農藥誘導雄性金魚(Carassiusauratus)性腺CYP19AmRNA表達量升高, 促進了T向E2的轉化, 從而引發一系列生殖毒性。此外, 金魚性腺中StAR、P450scc、3β-HSD、P450c17、P45011β、11β-HSD2mRNA 表達水平受到抑制, 而20β-HSD、17β-HSD1mRNA 表達水平則上調,說明有機磷農藥發揮類雌激素效應可能通過影響性激素合成過程中多種關鍵酶的表達水平, 導致血漿性激素含量的變化[40-41]。

此外, 部分有機磷農藥能夠模仿內源性激素與相應受體(包括雄激素受體、雌激素受體)結合, 形成配體受體復合物, 隨后結合到細胞核DNA結合域的雌激素反應元件上從而影響靶基因的轉錄, 進而擾亂一系列激素依賴性生理過程[42]。

1.2.2 影響HPG軸對性激素的調控

性激素的合成過程還受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)的影響, 其中垂體分泌的兩種促性腺激素(gonadotropic hormones, GtHs): 卵泡刺激素(folliclestimulating hormone, FSH)和促黃體激素(luteinizing hormone, LH)均能促進性類固醇激素的合成過程[43];而下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH)對于GtHs的分泌具有調節作用。因此, 有機磷農藥可通過干擾GtHs、GnRH分泌改變性激素的水平; 反之也可通過反饋作用調節GtHs、GnRH的釋放。例如Laura等[44]發現, 二嗪農能夠通過干擾藍鰓太陽魚(L.macrohirus)的 HPG 軸, 降低促性腺激素GtHs的生成, 進而抑制卵巢中雌激素的合成。27 mg/kg馬拉硫磷使雄性大鼠下丘腦GnRH含量顯著降低, 導致血漿 FSH、LH水平下降, 最終抑制的T合成, 引起精子數量下降、能動性減弱等生殖毒性[45]; 馬拉硫磷對印度囊鰓鯰(Heteropneustes fossilis)也具有類似的影響[46]。

2 有機磷農藥的抗雄激素效應及其機制

2.1 有機磷農藥抗雄激素效應

目前在體內篩選實驗中表現出抗雄激素效應的有機磷農藥見表2。有機磷農藥發揮抗雄激素效應能夠降低機體 T合成量, 而 T在雄性的生長發育中起著決定性作用, 可促進其第二性征出現、生殖器官發育并維持正常功能; 睪酮合成量受到影響最終會導致雄性精子數量、質量下降, 前列腺、儲精囊等器官重量減輕[51], 并干擾雄激素依賴性分化進程[52]。Viswanath等[47]報道, 毒死蜱、哌草磷能夠影響性激素合成過程中的關鍵酶(P450scc, 3β-HSD, 17β-HSD)的mRNA表達量, 導致Leydig細胞睪酮合成量顯著降低。Joshi等[53]以30 mg/kg甲基對硫磷暴露SD大鼠30 d, 暴露組大鼠睪丸、附睪、儲精囊和前列腺等雄激素依賴器官的質量較對照組分別下降了33.75%、9.89%、0.34%、11.72%。大鼠Hershberger實驗表明, 甲基毒死蜱在單獨使用時并不表現出抗雄激素效應, 但 50 mg/kg甲基毒死蜱與丙酸睪酮(testosterone propionate, TP)聯合暴露時, 大鼠的前列腺、儲精囊等器官重量顯著下降, 證明甲基毒死蜱可通過拮抗TP的雄激素活性, 發揮了抗雄激素效應[54]。此外, 雄激素(T、11-KT)具有調控雄激素受體(androgen receptor, AR)表達水平與功能的作用[55]。研究證明抗雄激素能夠通過下調雄激素含量, 導致肝臟、性腺等器官AR表達水平下降。例如, 敵敵畏暴露導致仔鼠陰莖皮膚組織中ARmRNA表達水平顯著降低[56]。另外, 環境抗雄激素黑名單中的利谷隆等也具有類似的作用[57]。

表2 發揮抗雄激素效應的有機磷農藥

有機磷農藥發揮抗雄激素效應, 能夠影響雄性生殖行為, 導致雄性性欲降低; 暴露妊娠大鼠會對其產下的子代雄性產生不利影響。殺螟硫磷暴露雄性三刺魚(Gasterosteus aculeatus)26 d, 能夠導致受雄激素調控的腎 spiggin膠蛋白濃度下降, 影響三刺魚的筑巢和求偶行為[58]。0.2 μg/mL毒死蜱暴露孔雀魚(Poecilia reticulata)3 d, 能夠顯著降低雄性孔雀魚性欲, 減少交配次數; 使雌性產仔數和子代存活率下降, 說明毒死蜱作為抗雄激素影響了孔雀魚的繁殖[59]。Turner等[60]則證明, 殺螟硫磷暴露妊娠大鼠, 導致產下的雄性子代大鼠出現生殖道發育異常, 表現為肛門到生殖器距離縮短, 從而影響子代大鼠的生殖能力。

由于有機磷農藥抗雄激素效應的研究還處于起步階段, 其發揮抗雄激素效應所引起的生殖毒性以及對子代的影響等方面遠不及類雌激素效應研究的深入, 并且該領域大多以大鼠、小鼠為實驗材料, 缺乏硬骨魚類、鳥類等物種的相關資料。另外, 有研究認為同一種 EDCs可能對雄/雌性產生不同的內分泌干擾效應。例如, 氰戊菊酯對雄性大鼠血清 E2含量無影響, 但能極顯著降低血清和睪丸的T含量, 抑制精子發生[61-62]。沈蘇南[63]則發現, 氰戊菊酯暴露導致雌性大鼠血漿E2含量顯著上升, T濃度無顯著性差異,則氰戊菊酯對雌性大鼠可能存在類雌激素效應。殺螟硫磷、咪鮮胺等對雄/雌性大鼠的暴露實驗也得到了類似的結論[64-65]。但是此類研究在有機磷農藥中開展較少, 需要拓展探究。

2.2 有機磷農藥抗雄激素效應可能機制

目前較為公認的環境抗雄激素大多通過影響AR信號通路來發揮作用。AR屬于核受體超家族中的類固醇受體, 由四個結構域組成: N端轉錄激活區(NTD)、DNA結合區(DBD)、鉸鏈區以及配體結合區(LBD)[66-67]。通常 LBD 與熱休克蛋白連接, 雄激素進入靶細胞后在胞漿內作為配體與AR結合, 使AR構型改變并解離熱休克蛋白, 從而增高與DNA親和力(亦稱作受體活化)。研究認為具有抗雄激素效應的有機磷農藥, 例如敵敵畏、毒死蜱、哌草磷等均與AR呈現一定的親和力[47-48], 在不引起細胞毒性的情況下對AR表現出拮抗作用, 阻止體內雄激素與AR結合, 抑制靶基因表達發揮抗雄激素效應。環境抗雄激素與 AR結合所引起的構型改變與正常的構型改變存在差異, 這種差異抑制了AR的活化, 使AR無法進入細胞核內與DNA結合, 導致相關基因的轉錄翻譯無法進行[68-69]。

正常情況下, 經過活化的AR會轉移到細胞核內,在一系列共調節因子作用下以頭對頭或頭對尾方式形成同源二聚體, 識別靶基因上的相關應答元件并與之結合, 進而誘導轉錄活化、基因表達, 促進性分化和性發育[70-73]。在調控靶基因轉錄過程中, AR需通過共調節因子并發生蛋白質-蛋白質相互作用, 才能有效地影響轉錄。Kelce等[74]認為環境抗雄激素可以通過影響共調節因子導致靶基因轉錄下調, 例如烯菌酮(vinclozolin, V)和二氯二苯三氯乙烷(1,1-dichloro-2, 2-bis(p-chlorophenyl)ethylene, p, p′-DDE)在機體內均能抑制由雄激素調節的prostateinsubunit C3基因表達, 但是有機磷農藥這方面的研究較為少見。

環境抗雄激素還可以影響HPG軸中某些環節的激素合成、分泌、激活、代謝來發揮作用。例如, 硫丹、氰戊菊酯暴露能通過抑制大鼠睪丸中17β-HSD、3β-HSD表達量影響 T的合成[75-76]。另有研究證明,甲基對硫磷能顯著降低長尾鸚鵡血漿中FSH、LH、T的水平, 并引起生殖腺重量下降、曲細精管直徑減小等生殖毒性, 這主要是由于甲基對硫磷通過降低HPG軸中GtHs的分泌, 抑制性類固醇激素合成過程,導致T水平下降引發生殖毒性, 發揮抗雄激素效應[77]。類固醇激素在水中的溶解度較小, 其轉運過程依賴于運載蛋白, 如睪酮需有睪酮結合球蛋白和白蛋白兩者運輸才能到達靶細胞[70]。因此, 影響相關運載蛋白也可以導致雄激素的分布和代謝發生改變, 從而產生抗雄激素作用, 但是在有機磷農藥中這方面的相關研究較少。

3 展望

3.1 開發新的生物標志物, 篩選具有抗雄激素效應的有機磷農藥

環境中的有機磷農藥多以低劑量形式存在, 開發靈敏度高、特異性強的生物標志物檢測抗雄激素類物質具有重要意義。近年來, 睪丸抑制前列腺信使2(TRPM-2)、附睪aquaporin9(AQP9)蛋白、芳香化酶等受雄激素調控的基因和蛋白成為潛在抗雄激素生物標志物[78-79]。然而, 有研究發現, 這幾種指標在不同的實驗生物中對抗雄激素類物質的反應存在一定差異。例如, p, p′-DDE暴露大鼠, 能誘導芳香化酶蛋白顯著增加, 但在大鼠肝細胞實驗中并沒有得到類似的結果[79]。因此, 今后需要大量研究驗證以上潛在抗雄激素生物標志物在不同物種中引起的反應是否一致, 是否能夠達到理想檢測敏感度, 以及是否比現有的生物標志物(spiggin蛋白、6α/15α-羥化酶比值)具有更廣泛的應用范圍等。

3.2 從多個層面探究有機磷農藥的抗雄激素效應機制

在有機磷農藥的抗雄激素效應機制的研究中,研究者側重于由雄激素受體信號通路介導的抗雄激素效應機制, 其他機制的研究相對較少。因此, 可以借鑒類雌激素機制的研究思路, 重點探究有機磷農藥作為環境抗雄激素對HPG軸的影響以及對激素合成、轉運的干擾。另外, 部分有機磷農藥在不同實驗條件下會表現出不同的內分泌干擾效應。例如, 殺螟硫磷在雄性大鼠的體內實驗中發揮抗雄激素效應,且在體外實驗中能夠競爭結合 AR[80-81]; 但單曉英等[82]發現, 殺螟硫磷能夠導致雌性大鼠子宮明顯增重,而大鼠子宮增重實驗是評價化學物具有雌激素活性的經典方法之一[83], 推測殺螟硫磷具有潛在的類雌激素效應?？梢? 同一種有機磷農藥在不同物種、不同性別、不同劑量的實驗條件下所發揮的內分泌干擾效應差異較大。因此, 在進行有機磷農藥的抗雄激素效應研究的過程中應當體內、體外實驗相結合, 選用分子、蛋白、器官、個體等多個層面的指標對作用條件及機制進行探索。

3.3 以對內分泌系統的研究為基礎, 探究與生殖系統、神經系統的相互影響

有機磷農藥作為類雌/抗雄激素對機體內分泌功能具有直接的擾亂作用, 然而其對內分泌系統的作用會間接導致對生殖細胞、生殖器官的毒性效應, 并最終導致機體的生殖能力下降。另外有研究證明, 有機磷農藥暴露能夠抑制機體包括下丘腦在內的多個腦部部位的乙酰膽堿酯酶活性[84-85], 下丘腦是機體HPG軸中重要的一環, 其分泌的GnRH對GtHs、T、E2等激素具有調節作用, 說明有機磷農藥的內分泌干擾效應與其神經毒性存在一定聯系。因此, 研究有機磷農藥的類雌、抗雄激素效應可將內分泌系統、生殖系統、神經系統相結合, 明確各系統間的相互作用, 以便對其作用機制做出更為全面的闡釋。

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