兼養對雨生紅球藻細胞生長的促進作用及藻株差異性

龍元薷 , 劉建國 , 張立濤

(1.中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2.南通中國科學院海洋研究所海洋科學與技術研究與發展中心, 江蘇 南通226000; 3.中國科學院大學, 北京100049)

蝦青素是迄今為止人類所發現的自然界生物體內最強的抗氧化劑, 在水產養殖、醫療衛生、化妝品和保健品等領域有廣泛應用前景[1-2]。在脅迫條件下,雨生紅球藻能迅速合成并大量積累蝦青素, 是自然界中天然蝦青素的最佳生物來源[3]。但是與其他經濟微藻相比, 雨生紅球藻生長速度較慢、抵御敵害能力較差[4], 如何縮短培養周期、提高藻細胞產量是當前雨生紅球藻蝦青素生產中需要致力解決的關鍵問題。雨生紅球藻不僅能光合自養, 同時可利用有機碳源進行異養生長及兼養生長。紅球藻的兼養生長由自養生長和異養生長兩部分組成, 可有效提高紅球藻生長速率和細胞產量[5]。在眾多有機物質中, 乙酸鈉(NaAc)最易紅球藻吸收利用, 促進細胞生長效果也最為明顯[6]。目前適宜雨生紅球藻生長的乙酸鈉質量濃度存在很大差異[7-8], 是否與藻株差異有關尚不清楚, 也缺少對兼養促進紅球藻生長機理上的深入研究。

葉綠素熒光技術已被廣泛應用于高等植物逆境生理研究, 近年來微藻脅迫生理分析也開始應用[9-10]。本研究以 4株不同品系雨生紅球藻為實驗材料, 在紅球藻兼養細胞密度和比生長速率分析基礎上, 結合葉綠素熒光技術初步比較研究了兼養對不同紅球藻藻株生長的促進作用及其機制, 目的為規模化生產篩選適宜的兼養藻株并尋找最適乙酸鈉質量濃度打下基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗藻種與基礎培養基

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)藻株H0、H2、H3、H6由中國科學院海洋研究所藻類與藻類生物技術實驗室保存, 基礎培養基選取MCM修正配方[11]。

1.2 培養方法

在修正 MCM 基礎培養基配方基礎上, 通過添加0.5和1.5 g/L乙酸鈉(每個質量濃度設3個重復)建立兼養培養條件。在100 mL三角瓶中分別加入上述培養液60 mL, 于121℃高溫下滅菌15 min, 待冷卻后分別接種15 mL處于對數生長期的紅球藻H0、H2、H3和 H6藻液, 置于室內培養架上靜置培養, 以日光燈為光源, 光照強度1 200 lx, 光照和黑暗周期L∶D為14∶10, 培養溫度控制在24℃±1℃。每天隨機調換三角瓶位置, 使各處理組藻液所接受的光照盡可能一致, 同時每天充分搖動三角燒瓶3~5次, 以增加藻細胞均勻度, 防止藻細胞發生貼壁生長, 連續培養觀察8~10 d, 每隔48 h從各處理組藻液中均勻取樣2 mL, 用于細胞生長和葉綠素熒光參數測定。

1.3 細胞計數、OD值測定與比生長速率計算

細胞顯微觀察計數: 藻液中紅球藻細胞數量,采用血球計數板結合顯微觀察計數的方法測得, 為減少人工帶來的可能統計誤差, 取樣前充分搖勻藻液, 每個樣本至少重復統計 20次, 細胞密度以平均值±標準差表示; 細胞比生長速率按照公式:μ=(lnN2－lnN1)/(T2－T1)計算, 式中μ為比生長速率(d-1),N2是T2時的細胞密度,N1是T1時的細胞密度[12]; 光吸收密度變化間接反映藻細胞生物量的變化, 所以藻細胞的生長同時采用 750 nm 波長光吸收值(A)表示, 利用722 型可見分光光度計和1 cm光徑比色杯測定。

1.4 葉綠素熒光參數測定

藻液取樣反應杯中暗適應15 min后, 利用英國Hansatech 公司Handy Pea 便攜式植物效率分析儀,測定相關葉綠素熒光參數。從分析儀上直接讀取以吸收光能為基礎、可準確反映植物細胞光合機構狀態的性能指數 PIABS值[13]。結合細胞生長和 PIABS的變化規律, 進一步分析兼養對 4株紅球藻細胞生理狀態的影響。

1.5 數據處理

用Sigmaplot軟件作圖。用SPSS 16.0軟件對數據進行相關性分析、方差分析以及多重比較(LSD)。

2 結果

2.1 兼養與光自養條件下紅球藻細胞生長對比

在兼養和光自養培養條件下, 4株紅球藻細胞密度變化如圖1所示。結果表明: 相對于自養而言, 兼養更有利于紅球藻細胞密度增加, 實驗 4株藻株在兼養條件下細胞密度最高可達到自養的3倍(圖1a)。不同藻株對乙酸鈉的反應及其適宜生長質量濃度存在明顯差異性。在 1.5 g/L乙酸鈉質量濃度兼養時,藻株 H0細胞密度相較自養顯著上升(P<0.01), 第 6天細胞密度達到 53.2×104個/mL, 而此時自養的 H0細胞只有19.5×104個/mL; 0.5 g/L乙酸鈉質量濃度下兼養, 藻株H0細胞生長較自養有一定程度的增加(圖1a) 但尚不顯著(P>0.05)。相反, 0.5 g/L乙酸鈉質量濃度下兼養, 藻株 H2細胞密度相較自養呈現顯著增高(P<0.05), 到培養后期甚至超過 1.5 g/L乙酸鈉質量濃度下兼養的細胞密度(圖1b)。藻株H3細胞密度在第8天達到最大值, 0.5和1.5 g/L乙酸鈉質量濃度下兼養的細胞密度分別接近自養的 1.5和 2倍(圖1c)。圖1中, H0、H2和H3兼養的細胞密度從培養第8天才開始出現明顯下降, 而藻株 H6在兼養的第 6天細胞密度達到最高后開始下降(圖1d)。此外, H6兼養細胞密度的上升幅度在 4株藻株中最小。盡管適宜于不同藻株生長的乙酸鈉質量濃度尚不十分確定,但上述結果至少表明, 適宜紅球藻細胞生長的乙酸鈉質量濃度大致可在1.5g/L左右。

圖1 4株紅球藻藻株在自養和兼養(NaAc+光)條件下的細胞密度變化Fig.1 Variation of cell densities in four strains of H. pluvialis under photoautotrophic and mixotrophic (NaAc + light) growth conditions

對比兼養和光自養條件下紅球藻比生長速率的變化趨勢(圖2)可以發現, 4株紅球藻比生長速率在兼養條件下均明顯高于自養培養, 兼養促進細胞生長效果在培養前期更顯著(P<0.05)。其中, 兼養對藻株H2的比生長速率的促進作用最大(圖2b), 對藻株H6比生長速率的促進作用最小(圖2d); 同時, 隨著培養的進行, 兼養促進紅球藻細胞生長的效應均呈線性下降趨勢, 到培養后期兼養與自養的比生長速率已經比較接近; 另外十分有意思的是, 兼養對生長的促進作用在紅球藻藻株之間也存在明顯差異, 比生長速率最快的H2藻株的和比生長速率最慢的H6藻株與乙酸鈉質量濃度之間(圖2b, 圖2d) 均未呈現明顯的劑量效應, 而比生長速率介于中間的H0和H3藻株與乙酸鈉質量濃度之間(圖2a, 圖2c)表現出明顯的劑量效應, 并且其比生長速率皆在 1.5g/L乙酸鈉質量濃度下出現進一步的明顯上升。可見1.5g/L乙酸鈉可作為紅球藻生長的適宜質量濃度, 這與細胞密度的分析結果基本一致。

圖2 不同乙酸鈉劑量下4株紅球藻比生長速率的變化Fig.2 Changes in specific growth rate of four strains of H. pluvialis exposed to NaAc at different concentrations

2.2 兼養對紅球藻光合綜合指數(PIABS)的影響

光合綜合性能指數 PIABS=(RC/ABS)·[φPo/(1–φPo)]·[φo/(1–φo)]包含了 RC / ABS、φPo和φo共 3個參數, 其分別代表反應中心的運行效率、光能吸收效率和電子傳遞效率, 并且3個參數相互獨立。所以性能指數PIABS對環境因子更敏感, 能夠更準確地反映植物光合機構的狀態[13]。4株紅球藻在自養和兼養培養條件下的光合綜合指數 PIABS值的變化(圖3)結果表明: 在培養前期(一般為前 2 d), 兼養培養的藻株(如H0、H2、H6) PIABS值較自養培養的低, 之后開始呈現不同程度上升。到培養后期(一般后2~4 d天),兼養培養藻株的PIABS值較自養培養明顯升高, 其中藻株 H0、H2(圖3a, 圖3b) 分別在1.5和0.5 g/L乙酸鈉質量濃度下 PIABS值較其自養顯著上升(P<0.05)。與其他3株實驗藻株不同, 藻株H3在培養初期兼養生長的 PIABS值與自養基本一致, 在 4~6 d H3兼養生長的PIABS值低于自養培養, 到第8天兼養的PIABS值才明顯高于其自養(圖3c)。上述結果表明,添加乙酸鈉兼養對紅球藻生長有促進作用, 該促進作用不僅在于乙酸鈉為紅球藻提供了異養生長的有機碳源, 同時還改變了紅球藻的光合生理狀態, 并且可將兼養對紅球藻細胞生長的促進作用分為兩個階段: 在兼養前期主要通過乙酸鈉異養加快細胞生長; 而培養后期當乙酸鈉快要耗盡時, 兼養通過提高藻細胞的光自養能力進一步促進細胞生長。

2.3 不同乙酸鈉質量濃度下 4株紅球藻生長及生理指標的對比

在不同乙酸鈉質量濃度下, 各藻株生長和生理指標(表1)顯示, 細胞從自養進入兼養, 紅球藻藻株之間呈現出某些共性和差異性變化, 主要包括:

(1) 隨乙酸鈉質量濃度上升, 反映細胞密度的A750nm均呈逐漸上升趨勢, 而在培養前期各藻株的光合性能綜合指數PIABS則呈相反的趨勢漸次下降, 這表明在培養前期兼養促進細胞密度的增加并非由其中光自養部分貢獻的, 而主要是由其中異養作用所導致。

圖3 乙酸鈉兼養對紅球藻光合綜合指數(PIABS)的影響Fig.3 Influences of NaAc on photosynthetic performance index (PIABS) in four strains of H. pluvialis under mixotrophic conditions

表1 不同乙酸鈉質量濃度兼養對4株紅球藻生長指標的影響Tab.1 Influences of diverse NaAc concentrations on various growth indexes of four H. pluvialis strains under mixotrophic (NaAc + light) conditions

(2) 在藻株之間, 自養與兼養的平均比生長速率、后期光合性能指數PIABS指標存在明顯差異性。藻株H2和藻株H6表現基本一致可劃為一組, 而藻株H0和藻株 H3大致類似為另外一組; 后者(藻株 H0、H3)的平均比生長速率和后期光自養綜合指數由自養轉入兼養后, 隨乙酸鈉質量濃度增加而增高; 而前者(藻株H2、H6)從自養轉入兼養后, 平均比生長速率明顯增高, 但此時兼養的平均比生長速率與乙酸鈉質量濃度之間不存在明顯劑量效應, 只是在后期的PIABS與乙酸鈉質量濃度存在劑量關系, 呈現先增高再下降的趨勢變化, 皆在 0.5g/L乙酸鈉質量濃度下光合性能綜合指數最高。

(3) 自養與兼養培養效率反映在最大比生長速率、平均光合性能指數PIABS指標上, 藻株之間也存在出明顯的差異性。藻株H2、H3、H6大致一致可劃為一組, 主要表現在 0.5g/L質量濃度下最大比生長速率最高、光合性能綜合指數最大; 藻株 H0單獨為另一組, 1.5g/L乙酸鈉質量濃度下其最大比生長速率最高、光合性能綜合指數也最大。

3 討論

微藻高密度培養是獲得生物質的基礎, 同時也是節約后續生產成本的重要手段[14]。添加有機碳兼養是獲得高密度藻細胞生物質的重要方法之一。兼養生長由光合自養及異養兩部分構成, 其最大特點是能同時利用光能和有機碳源進行生長[15], 可最大程度地加快藻細胞生長, 有機碳源提供的能量可減輕藻細胞生長對光合作用的依賴。本研究中, 乙酸鈉的添加不同程度地提高了 4株實驗藻株的比生長速率和細胞產量, 這與前期相關研究基本一致[5,8]。在紅球藻兼養研究上, Kobayashi等[5]認為光合生長與乙酸鈉異養代謝可同時獨立進行, 兼養生長速率是單獨自養與異養生長的總和。莊惠如等[6]也進一步證實紅球藻兼養生物量幾乎等于光養型生長與化能異養的總和。

本研究通過對比多株紅球藻兼養與自養的結果發現: 添加乙酸鈉兼養提高了紅球藻細胞的生長速率, 該促進作用并不是簡單地歸納為提供有機碳源進行異養和自養的相加, 事實上乙酸鈉還導致藻細胞光合生理狀態在前期和后期發生改變(圖3、表1),并且該光合生理狀態改變可能與乙酸鈉消耗程度也存在一定的關聯性。基于藻株對乙酸鈉的適應性及利用率的差別, 各藻株光合生理狀態的轉變在時間上以及乙酸鈉劑量效應上雖然存在一定差異, 但乙酸鈉導致光合生理狀態發生改變在不同紅球藻藻株都得到了印證。兼養的培養效果并非自養與異養的簡單疊加, 其中還存在其他多種綜合性效應。關于這方面深一步的研究甚少, 是下一步需要探明的基礎科學理論及產業化生產關注的重要應用技術。上述結果與 Yu等[15]在對發狀念珠藍細菌兼養得到的結論基本類似, 即在培養的不同階段, 兼養生長獲得的細胞產量與其對應的自養和異養生長總和的關系是波動的, 并非兩者的簡單相加。因此, 深入了解兼養下紅球藻的生長規律、掌握添加乙酸鈉的適宜質量濃度是非常有必要的, 進而有可能獲得紅球藻快速異養生長同時又顯著促進藻細胞光自養生長的雙重增益效果, 相反也有可能造成其作用部分抵消。

微藻異養需充足的有機碳源, 但乙酸鈉質量濃度過高會嚴重抑制藻細胞生長[6,16]。本研究中, 添加乙酸鈉可獲得相對較高的藻細胞生物量, 但不同藻株所需添加的乙酸鈉存在差異, 某些藻株(如 H2)在相對低的乙酸鈉質量濃度下(0.5g/L)細胞生長更好,細胞密度(圖1b、表1)、比生長速率(圖2b、表1)和綜合光合性能指數(圖3b、表1)都達到最大; 而另外一些藻株, 如H0則在較高乙酸鈉質量濃度(1.5g/L)下兼養效果更好, 無論細胞密度(圖1a、表1), 比生長速率(圖2a、表1)和綜合光合性能指數(圖3a、表1)均在1.5g/L乙酸鈉下達到最高值。根據不同藻株, 具體分析選擇合適的乙酸鈉添加量是獲得最佳培養效果的前提, 不能簡單地隨意添加。

對微藻生長情況的分析, 常通過建立細胞密度與藻液光密度值的相關方程, 以簡便快捷的光密度法檢測微藻的生長和生物量變化[17]。我們注意到乙酸鈉兼養不僅影響紅球藻細胞數量而且也影響細胞大小, 單憑光密度法檢測藻細胞生物量的變化準確性易受到干擾, 因而產生偏差。這也可能與紅球藻生活史復雜[2,7]有關, 在不同培養模式下處于不同生長階段的紅球藻細胞大小差異很大, 有時細胞直徑相差1~2倍, 細胞體積變化幅度高達數十倍, 無論光密度還是細胞數量等單一指標都不能準確反應其生物量變化, 應結合多種指標從不同角度全面檢測細胞的生長變化才更客觀、科學[18]。然而, 多指標測定勢必存在工作繁重、耗時長、樣本需要量大的問題[6],有時會僅限于宏觀和過后結果分析, 很難及時、快速掌握培養過程藻細胞的具體生長狀態。葉綠素熒光技術可對紅球藻的兼養生長狀態進行快速追蹤, 通過以吸收光能為基礎的性能指數PIABS可及時有效反映不同乙酸鈉質量濃度下紅球藻細胞的即時生理狀態, 并提供細致、全面的數據參考, 從而可對培養條件及時調整, 實現最佳培養效果。葉綠素熒光技術具備快速、靈敏、操作簡單、用量少等特點[13], 可作為紅球藻等微藻生理機理及生產應用研究有力、便捷的工具。

在兼養培養初期, 藻細胞性能指數PIABS相較自養生長出現下降(圖3、表1), 可能是由于實驗接種藻細胞來源于自養培養, 在接種后藻細胞對乙酸鈉環境需要一段時間進行適應。如果采用乙酸鈉兼養培養的藻種有可能避免此問題, 是否如此尚需進一步實驗驗證。隨著培養進行, 藻液中乙酸鈉和營養鹽不斷消耗, 藻細胞生長速率(圖2)逐漸下降, 到第 6天細胞增長幅度(圖1)呈現出明顯拐點。因此, 單就生物產量的有效獲得而言, 理論上生產周期維持在一周可保證藻細胞良好的繁殖狀態以及生物產量的高效供應, 這也是下一步生產性半連續培養中需要控制的時間節點。

紅球藻生長速度相對較慢, 沒有小球藻的快速繁殖力, 也不像螺旋藻、杜氏鹽藻等其他經濟微藻能夠在極端環境中生長, 因此其抵抗敵害生物能力較弱[4]。有機碳源(乙酸鈉)的添加在促進紅球藻生長的同時, 也加大了異養敵害生物的侵染風險。如何控制敵害生物污染, 把控好紅球藻細胞快速繁殖與敵害污染問題之間的平衡關系, 是目前紅球藻規模化兼養生產蝦青素急需突破的難題[3]。而生長速率的提高、培養過程紅球藻細胞良好生理狀態的維持皆有助于紅球藻抵御敵害的污染和競爭。所以在乙酸鈉適宜質量濃度的選擇上需進行綜合考慮, 在保證紅球藻快速生長的同時, 還需結合考慮乙酸鈉的添加對紅球藻光合自養生長促進作用的增益效應、保障藻細胞良好的生理狀態。

綜上所述, 0.5~1.5g/L乙酸鈉兼養對紅球藻細胞生長有明顯促進作用, 該促進作用在培養的前期主要通過乙酸鈉提供紅球藻異養生長的物質和能量基礎加快細胞生長; 培養后期乙酸鈉逐漸耗盡, 兼養通過提高紅球藻的光自養能力促進細胞的生長。同時, 兼養對紅球藻生長的促進作用存在明顯的藻株差異性, 不同藻株對乙酸鈉的需求量并不一致, 生產上需針對具體藻株添加適量的乙酸鈉, 實現生物量的有效增加。

[1]Kobayashi M, Kakizono T, Nishio N, et al.Antioxidant role of astaxanthin in the green algaHaematococcus pluvialis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1997, 48(3): 351-356.

[2]殷明焱, 劉建國, 張京浦, 等.雨生紅球藻和蝦青素研究述評[J].海洋湖沼通報, 1998, 2(2): 53-62.

[3]Margalith P Z.Production of ketocarotenoids by microalgae[J].Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 51(4):431-438.

[4]Del Campo J A, Garcia-Gonzalez M, Guerrero M G.Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(6): 1163-1174.

[5]Kobayashi M, Kakizono T, Yamaguchi K, et al.Growth and astaxanthin formation ofHaematococcus pluvialisin heterotrophic and mixotrophic conditions[J].Journal of Fermentation and Bioengineering, 1992, 74(1): 17-20.

[6]莊惠如, 陳必鏈, 王明茲, 等.雨生紅球藻混合營養與異養培養研究[J].微生物學通報, 2000, 27(3): 198-201.

[7]Kobayashi M, Kurimura Y, Kakizono T, et al.Morphological changes in the life cycle of the green algaHaematococcus pluvialis[J].Journal of Fermentation and Bioengineering, 1997, 84(1): 94-97.

[8]Gong X, Chen F.Optimization of culture medium for growth ofHaematococcus pluvialis[J].Journal of Applied Phycology, 1997, 9(5): 437-444.

[9]Liu X J, Duan S S, Li A F, et al.Effects of organic carbon sources on growth, photosynthesis, and respiration ofPhaeodactylum tricornutum[J].Journal of Applied Phycology, 2009, 21(2): 239-246.

[10]Wang H C, Cho M G, Riznichenko G, et al.Investigation of the maximum quantum yield of PS II inHaematococcus pluvialiscell cultures during growth: Effects of chemical or high-intensity light treatment[J].J Photochem Photobiol B-Biol, 2011, 104(3): 394-398.

[11]韓春梅, 劉建國, 張勇.紅球藻藻株對光強適應及在工程培養中的應用[J].海洋科學, 2010, 34(5): 21-28.

[12]張京浦, 劉建國.營養鹽對雨生紅球藻光合作用影響的研究[J].工業微生物, 1997, 27(4): 14-17.

[13]李鵬民, 高輝遠, Strasser R J.快速葉綠素熒光誘導動力學分析在光合作用研究中的應用[J].植物生理與分子生物學學報, 2005, 31(6): 559-566.

[14]Bumbak F, Cook S, Zachleder V, et al.Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes:achievements, potential and possible limitations[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91(1): 31-46.

[15]Yu H, Jia S, Dai Y.Growth characteristics of the cyanobacteriumNostoc flagelliformein photoautotrophic, mixotrophic and heterotrophic cultivation[J].Journal of Applied Phycology, 2009, 21(1): 127-133.

[16]Jeon Y C, Cho C W, Yun Y S.Combined effects of light intensity and acetate concentration on the growth of unicellular microalgaHaematococcus pluvialis[J].Enzyme Microb Technol, 2006, 39(3): 490-495.

[17]Cai Z P, Duan S S, Zhu H H.Optical density method and cell count method for determining the growth of three energy microalgae and their correlation and verification[J].Journal of Southern Agriculture, 2012, 43(10): 1480-1484.

[18]張展, 劉建國.微藻高密度培養中的生長指標和適應機制[J].海洋水產研究, 2003, 24(4): 36-43.