黨參水提物對D－半乳糖致衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量及超微結構的影響*

耿廣琴，楊雅麗，王 晶，黃 勇

(甘肅中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，甘肅蘭州730000)

衰老是一個復雜的多環(huán)節(jié)生物學過程，是生物界普遍存在的一種自然現象，是一切多細胞生物隨著時間的推移而表現出的各個細胞和器官功能的不可逆地、全面地、逐漸地喪失［1］。衰老雖不可逆轉，但可以緩解［2］。當今世界人口老齡化問題日趨嚴重，我國老齡化問題尤為嚴峻。面對衰老帶來的諸多社會、生活問題，開展老年醫(yī)學及老年生物學方面的研究，探討延緩衰老的方法，成為當前醫(yī)學界的研究熱點之一。甘肅道地中草藥黨參具有補中、益氣、生津之功效。研究報道顯示:注射或服用黨參水提物可以增強體質，提高人體免疫力，延緩衰老［3－4］。本實驗以D－半乳糖建立致衰老小鼠模型，研究黨參水提物對衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量和超微結構的影響，旨在探討中藥黨參保肝護腎抗衰老的機制，以使其更好地發(fā)揮藥用價值，同時為中醫(yī)藥延緩衰老機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

PF級昆明種小鼠100只，2月齡，雌雄各半，體質量(18±2)g，購自甘肅中醫(yī)學院科研實驗動物中心，合格證號:SCXK(甘)2011－0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

黨參，采自甘肅岷縣，經甘肅中醫(yī)學院中藥學教研室鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并兩次提取液，過濾后，濃縮成含生藥0.5 g/mL的水煎劑，置4℃冰箱備用，水煎液每5 d制備1次。D－半乳糖，美國Sigma公司產品，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L，備用;考馬斯亮藍測定試劑盒(批號20130819)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20130726)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20130726)，均購自南京建成生物工程研究所。BS224S型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品;HH－4數顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產品;XYJ80－20型離心機，金壇市恒豐儀器廠產品;XW－80A型旋渦混勻器，上海精科實業(yè)有限公司產品;VIS－723N型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司產品;JEOL－1230透射電子顯微鏡，日本電子公司產品。

1.3 動物分組及模型的建立

將100只小鼠，隨機分為正常對照組、模型對照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組，每組20只，雌雄各半。模型對照組、黨參水提物各劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射質量分數50 g/L的 D－半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g，正常對照組注射等體積量生理鹽水。采用灌胃給藥法，黨參水提物低、中、高劑量組每日上午按相當于生藥量5，10，15 g/kg劑量給藥，正常對照組、模型對照組灌服等體積生理鹽水，與造模同步，連續(xù)42 d。

1.4 檢測指標

于末次給藥2 h后，稱量各組小鼠體質量;斷頭處死小鼠，迅速剖取胸腺、脾、肝、腎，用預冷的4℃生理鹽水洗凈表面殘血，備用。

1.4.1 胸腺、脾臟指數

將胸腺、脾臟用濾紙吸干，電子天平稱量質量，臟器指數=內臟質量(mg)/體質量(g)。

1.4.2 SOD 活性、MDA 含量

分別取大鼠肝、腎組織塊約0.3 g，用預冷的生理鹽水制備成100 g/L的肝勻漿和腎勻漿，3 000 r/min離心5 min，上清液 －20℃凍存，用于SOD活性、MDA含量測定。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法(TBA)法，組織蛋白含量的測定采用考馬斯亮蘭法。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 超微結構觀察

取大鼠肝及腎皮質組織結構1 mm3，分別固定于1/15 mol/L磷酸緩沖液(PBS)配制的30 g/L戊二醛固定液中2 h;PBS液漂洗3次，每次10 min;10 g/L鋨酸固定 1.5 h;PBS液漂洗 3次，每次10 min;500，700，800，900，1000 g/L 乙醇梯度脫水，每次10 min;純丙酮脫水2次，每次10 min;EPON-812環(huán)氧樹脂∶純丙酮(1∶1)浸透2 h;EPON-812環(huán)氧樹脂包埋;聚合(35℃ 24 h，45℃ 24 h，65℃24 h);半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位;超薄切片，透射電子顯微鏡觀察。

1.5 統計學方法

采用SPSS13.0軟件對數據進行統計與分析，數據以平均數±標準誤差(mean±SDs)表示，組間比較采用one-way ANOVA分析。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠胸腺、脾臟指數對比

與正常對照組對比，模型對照組胸腺指數下降，差別有統計學意義(P＜0.01);與模型對照組對比，黨參水提物3個劑量組胸腺指數增高，但差別無統計學意義(P＞0.05)。與正常對照組對比，模型對照組脾臟指數降低，但差別無統計學意義(P＞0.05);與模型對照組對比，黨參水提物3個劑量組脾臟指數均升高，但差別均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠胸腺指數、脾指數對比 mean±SDs

2.2 各組小鼠肝、腎SOD活力及MDA含量對比

正常對照組肝臟中SOD活性顯著高于模型對照組(P＜0.01)，黨參水提物低、中、高劑量組肝臟中SOD活性均高于模型對照組，其中高劑量組肝臟中SOD活性較之差別有統計學意義(P＜0.05)。正常對照組腎臟中SOD活性顯著高于模型對照組(P＜0.01);黨參水提物低、中、高劑量組腎臟中SOD活性均高于模型對照組，其中中、高劑量組腎臟中SOD活性較之差別有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。與模型對照組小鼠對比，正常對照組和黨參水提物低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量均降低，其中正常對照組、高劑量組較之差別有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，正常對照組和黨參水提物低、中、高劑量組小鼠腎臟組織中MDA含量均降低，其中正常對照組、黨參水提物中、高劑量組較之差別有統計學意義(P＜0.05或P ＜0.01)。見表2。

表2 各組小鼠肝、腎中SOD活力、MDA含量對比 mean±SDs

2.3 各組小鼠肝、腎超微結構對比

肝臟超微結構變化見圖1。正常對照組肝細胞核呈橢圓形，核膜平整光滑，核周少量異染色質，胞質內細胞器豐富，粗面內質網、線粒體、核糖體等結構正常。模型對照組肝細胞核體積相對于正常略有縮小，核異染色質增多，胞質內局部細胞器線粒體、內質網數量明顯減少，殘留較多糖原顆粒，及少量脂滴，并可見部分胞質內線粒體腫脹。黨參水提物低劑量組肝細胞胞質內部分線粒體腫脹。黨參水提物中劑量組肝細胞核形態(tài)正常，胞質內線粒體結構正常，內質網輕中度擴張。黨參水提物高劑量組肝細胞結構正常。

腎臟超微結構變化見圖2。正常對照組腎近曲小管上皮細胞結構、胞質內線粒體正常，游離面致密，微絨毛結構排列整齊。模型對照組腎小管上皮細胞胞質內線粒體腫脹、體積增大，線粒體嵴溶解，減少。黨參水提物低劑量組腎小管上皮細胞胞質細胞器腫脹，游離面微絨毛稀疏、脫落或完全消失。黨參水提物中劑量組腎小球內部分毛細血管節(jié)段系膜細胞、系膜基質輕度增生，但程度明顯輕于模型對照組，足細胞足突結構基本正常。黨參水提物高劑量組大部分腎小管上皮細胞胞質內細胞器結構正常，僅見少量線粒體腫脹。

圖1 各組小鼠肝臟超微結構(×10 000)

圖2 各組小鼠腎臟超微結構(×10 000)

3 討論

中醫(yī)學認為:衰老是整體性的、退行性的變化過程，而五臟虛損是衰老整體變化中的核心部分。隨著年齡增長，機體五臟逐漸虛損，最終五臟皆虛，而盡終其天年。五臟虛損不僅是衰老的特征表現，也是導致衰老的重要原因［5］。五臟之中，腎與衰老的關系最為密切［6］，肝與衰老的關系也非常明朗［7］。“腎元盛則壽延，腎元衰則壽夭”(《醫(yī)學正傳》)，人體衰老與否，以及衰老的速度、衰老的程度、壽命的長短主要取決于腎氣的強弱。肝與衰老的關系始載于《靈樞·天年》，曰:“五十歲，肝氣始衰，肝葉始薄，膽汁始滅，目始不明……”此明確提出了肝在衰老過程中居于先導地位［8］。本研究結果顯示:模型對照組肝、腎中SOD活性明顯下降，MDA含量升高，胸腺指數下降，符合衰老的一些病理學特征［9－10］，表明本實驗衰老模型的建立是成功的。給予動物模型黨參水提物后，可阻止衰老的發(fā)展，其中黨參水提物高劑量組諸指標基本恢復或接近正常水平，表明:黨參可以通過提高肝、腎SOD活性，顯著降低體內MDA含量，減輕脂質過氧化對機體造成的損傷，對延緩衰老能起到了積極作用。

電鏡觀察結果表明:與正常對照組對比，模型對照組肝臟超微結構出現了明顯異常改變，主要表現為細胞核體積相對縮小，胞質內線粒體腫脹，線粒體、內質網數量明顯減少。給予黨參水提物后，中劑量組肝臟超微結構明顯改善，高劑量組肝細胞結構恢復正常。與正常對照組對比，模型對照組腎小管上皮細胞胞質內線粒體腫脹，嵴溶解、減少。給予黨參水提物后，中、高劑量組腎臟超微結構的異常變化明顯緩解。線粒體是細胞內能量合成的主要場所，內質網是蛋白質的合成與加工的部位，細胞作為生物體結構與功能的基本單位，只有保持其完整性，才能正常完成各項生命活動。可見黨參可以抑制衰老導致的小鼠肝、腎組織超微結構的異常變化，對維持細胞結構的完整性、維持細胞正常生理功能起到了重要的作用。從衰老致小鼠肝、腎超微結構的變化程度來看，腎臟的損傷程度明顯大于肝臟的損傷程度、這與肝、腎中SOD活性、MDA含量的變化一致，這或許是因為，相對于腎臟，肝臟自我修復和代償能力較強。

綜上所述，黨參水提物可增強機體的抗氧化能力，減輕脂質過氧化對機體造成的損傷，延緩肝、腎細胞超微結構變化，具有保肝護腎，減慢衰老進程的作用，其中高劑量的效果更為理想。

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