夫西地酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的體外抗菌活性研究

馬英 劉曄 王倩倩 吳湜 楊洋 黃海輝 項(xiàng)蕾紅

夫西地酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的體外抗菌活性研究

馬英 劉曄 王倩倩 吳湜 楊洋 黃海輝 項(xiàng)蕾紅

目的評(píng)價(jià)夫西地酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的體外抗菌活性。方法上海華山醫(yī)院2013年3-9月收集的50株痤瘡丙酸桿菌，按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定夫西地酸及其他抗菌藥的最低抑菌濃度（MIC）。數(shù)據(jù)分析采用WHONET 5.4軟件。結(jié)果夫西地酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC50和MIC90分別為0.5和1.0 mg/L，敏感率為90%；莫西沙星與夫西地酸大致相仿，敏感率為90%；克林霉素和紅霉素的敏感率分別為54%和46%，MIC90值均＞128 mg/L；對(duì)甲硝唑耐藥。在藥物質(zhì)量濃度為128 mg/L時(shí)，克林霉素的累積抑菌率達(dá)到70%，紅霉素只有48%，而夫西地酸在2 mg/L時(shí)的累積抑菌率已達(dá)到100%。結(jié)論夫西地酸對(duì)臨床分離的痤瘡丙酸桿菌具有良好的體外抗菌活性。

丙酸桿菌，痤瘡；梭鏈孢酸；微生物敏感性試驗(yàn)

夫西地酸（fusidic acid）是一種水溶性鈉鹽，是從紅色梭鏈孢霉提取、唯一有類似甾族化合物結(jié)構(gòu)而沒(méi)有類固醇活性的抗生素［1］，為窄譜抗革蘭陽(yáng)性菌藥物，對(duì)葡萄球菌具有較強(qiáng)抗菌活性，也可抗多種厭氧菌和其他細(xì)菌如梭狀芽孢菌屬、棒狀桿菌等。基于夫西地酸的這些特性，有研究［2］觀察了夫西地酸治療痤瘡的療效。本試驗(yàn)評(píng)價(jià)夫西地酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的體外抗菌活性。

一、材料

1.細(xì)菌來(lái)源：痤瘡丙酸桿菌分離自2013年3-9月我院皮膚科門診中重度痤瘡患者皮損組織，脆弱擬桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25285由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所惠贈(zèng)，痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 6919購(gòu)自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。本研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

2.抗菌藥物：夫西地酸標(biāo)準(zhǔn)品，香港澳美制藥廠生產(chǎn)；甲硝唑、克林霉素、紅霉素、頭孢曲松、頭孢西丁、米諾環(huán)素、四環(huán)素、氨芐西林、舒巴坦等標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院技術(shù)服務(wù)部；亞胺培南，默沙東公司產(chǎn)品；莫西沙星，拜耳公司產(chǎn)品；氨芐西林/舒巴坦的配比按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）標(biāo)準(zhǔn)推薦為2∶1。

3.培養(yǎng)基和主要試劑：布氏桿菌瓊脂為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，血紅素和維生素K1為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；脫纖維羊血為上海閔行區(qū)諸翟無(wú)菌動(dòng)物血試劑供應(yīng)站產(chǎn)品；痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)所需的厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧菌鑒定API 20A條均為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

二、方法

1.細(xì)菌鑒定：用碘酊消毒患者膿皰處，用針頭刺破皮膚表面，擠出膿液，以無(wú)菌棉拭子沾取膿血，同時(shí)接種厭氧和需氧血瓊脂平板，37℃孵育48～72 h后觀察菌落，分離純化并連續(xù)3次耐氧試驗(yàn)（厭氧環(huán)境的氣體條件為5%CO2、10%H2、85%N2）。分離細(xì)菌并經(jīng)涂片、革蘭染色鏡檢后，用API 20A厭氧菌鑒定條鑒定為痤瘡丙酸桿菌后，置于40%甘油肉湯，-70℃冰箱菌種保存，留待藥敏試驗(yàn)。

2.夫西地酸抗菌活性測(cè)定：按CLSI標(biāo)準(zhǔn)M11-A8，采用瓊脂稀釋法，測(cè)定夫西地酸等抗菌藥物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌濃度（MIC），用直接菌落懸浮法制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木海捎肈ENLEY A400多點(diǎn)接種儀將受試菌懸液接種于含不同抗菌藥物濃度的瓊脂上。痤瘡丙酸桿菌的接種菌量為105CFU/點(diǎn)，抗菌藥物的測(cè)試質(zhì)量濃度為0.06～128 mg/L，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后閱讀結(jié)果。

3.結(jié)果分析和判斷標(biāo)準(zhǔn)：獲得的結(jié)果按CLSI2013 M100-S23標(biāo)準(zhǔn)［3］進(jìn)行分析，其中夫西地酸采用EUCAST2010臨界濃度標(biāo)準(zhǔn)［4］，數(shù)據(jù)分析采用WHONET 5.4軟件。累積抑菌率（%）=抑菌菌數(shù)總和/總菌數(shù)×100%。

三、結(jié)果

1.痤瘡丙酸桿菌的培養(yǎng)與鑒定：從66例痤瘡患者皮損標(biāo)本中共分離出50株痤瘡丙酸桿菌，陽(yáng)性檢出率為75.8%。

2.夫西地酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抗菌活性（表1）：夫西地酸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC范圍為0.25～2 mg/L，MIC50和MIC90值分別為0.5和1.0 mg/L。對(duì)夫西地酸的敏感率按EUCAST2010標(biāo)準(zhǔn)為90%，未發(fā)現(xiàn)耐藥株。

表1 夫西地酸及其他抗菌藥對(duì)50株痤瘡丙酸桿菌的體外敏感率、耐藥率

3.夫西地酸與其他抗菌藥物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抗菌活性比較（表1）：夫西地酸對(duì)50株痤瘡丙酸桿菌的抑菌率約為90%，MIC90為1 mg/L，優(yōu)于紅霉素和克林霉素，并且明顯優(yōu)于甲硝唑。后三者的MIC90均≥128 mg/L，其中，紅霉素的抑菌率為46%，克林霉素為54%；甲硝唑?qū)︷畀彵釛U菌無(wú)抑菌作用，耐藥。莫西沙星對(duì)50株痤瘡丙酸桿菌的抑菌率為90%。與β-內(nèi)酰胺類相比，夫西地酸的抗菌作用略差于氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢西丁及亞胺培南。后者的MIC90為≤0.06～0.5 mg/L，抑菌率為100%。夫西地酸與克林霉素和紅霉素累積抑菌率比較發(fā)現(xiàn)，在藥物質(zhì)量濃度為128 mg/L時(shí)，克林霉素的累積抑菌率達(dá)到70%，紅霉素只有48%，而夫西地酸在2 mg/L時(shí)的累積抑菌率已達(dá)到100%，明顯優(yōu)于前兩者。

四、討論

痤瘡丙酸桿菌通過(guò)免疫和非免疫途徑引起皮損局部炎癥反應(yīng)［5］。隨著口服或外用抗生素在治療痤瘡中的廣泛使用，痤瘡丙酸桿菌對(duì)抗生素的敏感性逐漸降低［6］。在33例長(zhǎng)期接受四環(huán)素治療的痤瘡患者中，四環(huán)素對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC是未接受抗生素治療的痤瘡患者或健康受試者的4～5倍，在長(zhǎng)時(shí)間接受紅霉素治療的患者中紅霉素的平均MIC是其他患者或健康受試者的100倍以上［7］。經(jīng)過(guò)抗生素治療的痤瘡患者耐藥菌攜帶率明顯高于未接受治療的患者，而且治療無(wú)效或者病情復(fù)發(fā)者耐藥菌的攜帶率高于治療有效的患者，提示口服或外用抗生素均可誘導(dǎo)該菌產(chǎn)生耐藥性，并且與治療失敗有關(guān)。Ross等［8］對(duì)歐洲多中心664例痤瘡患者面部耐藥性痤瘡丙酸桿菌攜帶率及其表型的研究也發(fā)現(xiàn)，痤瘡患者中耐藥性痤瘡丙酸桿菌的攜帶率均較高，而且對(duì)紅霉素和林可霉素同時(shí)耐藥的發(fā)生率高于四環(huán)素。我們的研究顯示，受試痤瘡丙酸桿菌對(duì)紅霉素的耐藥率為54%，對(duì)克林霉素的耐藥率為34%，而對(duì)甲硝唑則全部耐藥。

夫西地酸主要是通過(guò)干擾延長(zhǎng)因子G（EF-G）抑制細(xì)菌核糖體的易位、阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而產(chǎn)生殺菌作用，因其獨(dú)特的作用機(jī)制，避免了與其他抗菌藥物的交叉耐藥性。臨床使用40余年的經(jīng)驗(yàn)表明，它能有效地治療葡萄球菌所致的敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染、骨與關(guān)節(jié)感染［9］。夫西地酸同時(shí)可以很好地治療特應(yīng)性皮炎繼發(fā)的皮膚感染［10］。其通過(guò)抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成而產(chǎn)生抗菌作用，對(duì)痤瘡丙酸桿菌同樣具有較好的抗菌活性。本研究結(jié)果顯示，夫西地酸對(duì)2013年3-9月我院皮膚科門診患者組織培養(yǎng)所得的痤瘡丙酸桿菌仍保持較高的抗菌活性。該菌對(duì)夫西地酸的敏感率達(dá)到90%，未發(fā)現(xiàn)耐藥株。相比較該菌對(duì)紅霉素54%的耐藥率和對(duì)克林霉素34%的耐藥率，夫西地酸的抗菌活性明顯優(yōu)于這兩者。雖然莫西沙星的抑菌率也達(dá)到90%，β-內(nèi)酰胺類更是達(dá)到100%，但是對(duì)系統(tǒng)性感染目前主要或常用的抗生素我們都要盡量避免選擇［11］。本研究中米諾環(huán)素和四環(huán)素同樣有優(yōu)越的抗菌活性，但兩者都是系統(tǒng)使用抗生素，有潛在的各種不良反應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道夫西地酸不僅能直接殺滅細(xì)菌，還可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)起到抗炎作用［12］，能迅速消除細(xì)菌所致的細(xì)胞水腫、滲出、變性、壞死等炎癥反應(yīng)，并且由于夫西地酸抗菌譜窄，不易引起菌種耐藥，組織、體液分布廣，血漿半衰期長(zhǎng)，患者耐受性好，已成為治療痤瘡丙酸桿菌的又一選擇。

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2014-02-14）

（本文編輯：顏艷）

In vitroevaluation of antibacterial activity of fusidic acid againstPropionbacterium acnes

Ma Ying*,Liu Ye,Wang Qianqian,Wu Shi,Yang Yang,Huang Haihui,Xiang Leihong.*Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

s；Xiang Leihong,Email；flora-xiang@vip.163.com；Huang Haihui,Email；huanghaihui@fudan.edu.cn

ObjectiveTo evaluate thein vitroantibacterial activity of fusidic acid againstP.acnes.MethodsFifty strains ofP.acneswere clinically isolated from Huashan Hospital,Fudan University from March to September 2013.The minimum inhibitory concentrations （MICs） of several antibacterial agents including fusidic acid against theseP.acnesisolates were determined by using the agar dilution method according to the recommendations of Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Data were analyzed using the WHONET 5.4 software.ResultsAmong the 50P.acnesisolates,90%were sensitive to fusidic acid,90%to moxifloxacin,54%to clindamycin,46%to erythromycin,but 100%were resistant to metronidazole.The minimum concentration required to inhibit the growth of 50%organisms（MIC50） and 90%organisms（MIC90） were 0.5 and 1.0 mg/L respectively for fusidic acid,whereas clindamycin and erythromycin both showed higher MIC90 values （＞ 128 mg/L）.At the concentration of 128 mg/L,clindamycin inhibited the growth of 70%of theP.acnesisolates,and erythromycin inhibited the growth of 48%of them,while the growth of all the isolates was inhibited by fusidic acid at 2 mg/L.ConclusionFusidic acid exhibits excellent antibacterial activity against clinical isolates ofP.acnes in vitro.

Propionibacterium acnes；Fusidic acid；Microbial sensitivity tests

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.018

國(guó)家科技部“國(guó)家科技重大新藥創(chuàng)制”專項(xiàng)資助（2012ZX09303004-001）；2013年中西醫(yī)結(jié)合（CAIM）-澳美中國(guó)痤瘡研究基金

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科（馬英、劉曄、王倩倩、項(xiàng)蕾紅），抗生素研究所（吳湜、黃海輝、楊洋）

項(xiàng)蕾紅，Email：flora-xiang@vip.163.com；黃海輝，Email：huanghaihui@fudan.edu.cn