Notch-RBP-J 信號通路對小鼠黑素瘤細胞B16F10與小鼠單核巨噬細胞RAW264.7共培養巨噬細胞極化影響的研究

吳瓊 陳浩 周武慶 李阿梅 呂雅琳 胡彬 姜祎群 孫建方

·論著·

Notch-RBP-J 信號通路對小鼠黑素瘤細胞B16F10與小鼠單核巨噬細胞RAW264.7共培養巨噬細胞極化影響的研究

吳瓊 陳浩 周武慶 李阿梅 呂雅琳 胡彬 姜祎群 孫建方

目的探討小鼠黑素瘤細胞B16F10與小鼠單核巨噬細胞RAW264.7共培養中Notch-RBP-J信號通路對巨噬細胞表型分化的影響。方法設計針對CBF1/RBP-Jκ基因的siRNA編碼序列，轉染至小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞。實驗分4組：沉默前共培養組，B16F10細胞與RAW264.7細胞共培養；沉默后共培養組，B16F10細胞與RBP-Jκ基因沉默后的RAW264.7細胞共培養；空白對照組，單獨培養的RAW264.7細胞；陽性對照組，白細胞介素4刺激誘導的RAW264.7細胞。Western印跡法、ELISA法及流式細胞儀檢測各組巨噬細胞的表型；RT-PCR法檢測各組notch1、notch2、DLL1、DLL4及Hes1的表達。采用SPSS17.0軟件進行重復測量方差分析及單因素方差分析、線性趨勢檢驗、Bonferroni兩兩比較。結果Western印跡結果顯示，RAW264.7與B16F10共培養不同時間后，RAW264.7細胞的CD163在空白對照組、共培養24 h、48 h、72 h組、陽性對照組的相對表達量分別為1.016± 0.018、1.274±0.034、2.065±0.094、3.615±0.144、3.099±0.071，經單因素方差分析（n=4），F =527.42，P ＜0.01，共培養后RAW264.7細胞CD163表達量較空白對照組增加；ELISA檢測結果顯示，共培養24、48、72 h，RAW264.7細胞培養上清液白細胞介素10的水平分別為（167.610±3.527）、（433.433 ± 5.558）、（679.673 ± 8.101） ng/L。沉默后共培養 24、48、72 h，RAW264.7細胞培養上清液白細胞介素10表達量分別為（63.403± 0.856）、（103.427± 2.072）、（202.297± 3.610）ng/L，較未沉默時降低（F=8.01，P＜0.05）。Western印跡法及流式細胞儀分別檢測沉默后共培養RAW264.7細胞CD163、CD206的表達量，均較未沉默時減少（P＜0.05）。RT-PCR示，沉默后共培養組較沉默前共培養組及對照組的Notch信號通路相關基因mRNA表達均降低。結論沉默Notch-RBP-J信號通路后共培養組中RAW264.7細胞向M2型極化較未沉默共培養組減少，總體表型仍為M2型；該通路的活化促進RAW264.7細胞向M2型極化。

Notch-RBP-J信號通路；巨噬細胞極化；共同培養技術

巨噬細胞是腫瘤間質炎癥中的一種主要細胞，然而，在大多數實體瘤中，巨噬細胞的存在有利于腫瘤的生長和轉移。腫瘤相關巨噬細胞（tumorassociated macrophages，TAM）通過產生白細胞介素10（IL-10）以及腫瘤生長因子 β（TGF-β）來抑制抗腫瘤的免疫反應，同時可能通過分泌前血管生成因子促進腫瘤的血管新生，并通過改變腫瘤微環境協助腫瘤的轉移及擴散［1-2］。巨噬細胞根據環境不同大致可極化為經典活化型巨噬細胞（M1型）及替代活化型巨噬細胞（M2型）［3］。M1型巨噬細胞介導Th1型免疫應答，殺滅細胞內微生物及腫瘤細胞，并釋放大量促炎因子；M2型巨噬細胞參與誘導Th2型免疫應答，清除殘留物，促進血管生成，參與組織重塑和修復，并具有促腫瘤的作用［4］。M1型及M2型巨噬細胞在腫瘤中的作用截然相反。在腫瘤組織內，巨噬細胞受到腫瘤微環境多種因素的影響，獲得TAM表型，表現出M2型巨噬細胞的特性［5］。本研究旨在通過共培養小鼠黑素瘤細胞B16F10及小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，觀察共培養對巨噬細胞表型的影響，探討發生影響的機制。

材料和方法

一、材料

1.主要試劑與耗材：RPMI1640細胞培養基、DMEM高糖細胞培養基、Trizol及轉染試劑產自美國Invitrogen公司，牛血清產自美國ExCell Biology公司；流式抗體CD206產自美國ebioscience公司，兔抗人CD163抗體產自博奧森公司，IL-10及IL-4、IL-12、RT-PCR試劑盒產自南京凱基生物科技發展有限公司；6孔Transwell板產自美國Corning公司。

2.細胞系：B16F10細胞系來自美國標準生物品收藏中心，本所中心實驗室保存；RAW264.7細胞來自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

二、方法

1.實驗分組：沉默前共培養組：B16F10細胞與RAW264.7細胞共培養；沉默后共培養組：B16F10細胞與RBP-Jκ基因沉默后的RAW264.7細胞共培養；空白對照組：單獨培養的RAW264.7細胞；陽性對照組：白細胞介素4刺激誘導的RAW264.7細胞。

2.細胞轉染：根據Gene bank中CBF1/RBP-Jκ基因的序列，針對不同位點設計20nt左右的siRNA序列，通過脂質體轉染至RAW264.7細胞，提取細胞總RNA，RT-qPCR檢測沉默效率。

3.B16F10與RBP-Jκ基因沉默前后的RAW264.7細胞共培養：在孔徑0.4 μm的transwell小室下室接種沉默前后的RAW264.7細胞（5×104個/孔）過夜，待細胞貼壁后，上室接種B16F10細胞（104個/孔），分別共培養24、48、72 h后，吸取下室培養基檢測沉默前后的RAW264.7表型的變化，并收集細胞。

4.IL-4刺激誘導RAW264.7細胞：誘導前1 d，接種適當數量的細胞至細胞培養板中，加入不含抗生素的培養基，細胞密度30%～50%，過夜貼壁后用含有50 μg/L IL-4的培養基培養48 h。

5.Western印跡法檢測共培養后RAW264.7細胞表型：提取各組總蛋白，常規進行SDS-PAGE電泳，使用Gel-Pro32軟件對結果進行灰度分析。

6.ELISA法檢測共培養后RAW264.7細胞表型：共培養后收集RAW264.7細胞培養基，離心取上清液，用ELISA試劑盒檢測上清液中IL-10、IL-12的表達。

7.流式細胞儀檢測共培養后RAW264.7細胞表型：胰酶消化計數，5×105個/管，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 1 次，100 μl PBS重懸，加 1 μg抗體，4 ℃共育30 min，PBS洗去游離的抗體，用0.5 ml PBS重懸后，流式細胞儀FACSCalibu檢測。

8.RT-PCR法檢測各組細胞 notch1、notch2、DLL1、DLL4及Hes1的表達：Trizol法提取各組細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，按照說明書進行RT-PCR檢測。Notch1 上游引物：5′-CCTGCCACTATGGTTCC TGT-3′，下游引物：5′-GGGTTGGACTCACACTCGT T-3′；Notch2 上游引物：5′-ACCCTTGTATGCACGGA GTC-3′，下游引物：5′-CCAGGTTATTGCACGTTCC T-3′；DLL1 上游引物：5′-TGCAGGAGTTCGTCAAC AAG-3′，下游引物：5′-CTCCCCTGGTTTGTCACAG T-3′；DLL4 上游引物：5′-GCCTCTCGAACTTGGACT TG-3′，下游引物：5′-AGCTCCTGCTTAATGCCAAA-3′；Hes1 上游引物：5′-GGTGCTGATAACAGCGGAAT-3′，下游引物：5′-ATGCCGGGAGCTATCTTTCT-3′。

9.統計學分析：實驗重復3次，采用SPSS17.0軟件進行重復測量及單因素方差分析、線性趨勢檢驗、Bonferroni兩兩比較，數據以±s表示。

結 果

一、RAW264.7細胞與B16F10細胞共培養不同時間后CD163的變化

RAW264.7細胞的CD163在空白對照組、共培養24、48、72 h組、陽性對照組的相對表達量分別為1.016 ± 0.018、1.274 ± 0.034、2.065 ± 0.094、3.615 ±0.144、3.099 ± 0.071，經單因素方差分析（n=4），F=527.42，P＜0.01，CD163表達在共培養組隨時間延長表達量增加（圖1）。

二、Western印跡檢測RAW264.7與B16F10共培養后表型的變化

經重復測量方差分析，沉默后與沉默前共培養組比較，RAW264.7細胞CD163表達量下降，差異有統計學意義（n=1.021，F=8.85，P＜ 0.05）；線性趨勢檢驗示，在沉默后與沉默前兩組內部 24、48、72 h 三個時間點，CD163的表達量成線性趨勢（n=1，F=18.99，P=0.007），隨時間延長表達量增加。見圖2、表1。

三、ELISA法檢測RAW264.7與B16F10共培養后 IL-10、IL-12 的變化

重復測量方差分析及線性趨勢檢驗結果表明，沉默后與沉默前共培養組比較，IL-10表達量下降，差異有統計學意義（P＜0.05），且在兩組內部3個時間點，IL-10的表達量成線性趨勢（n=1，F=15.20，P＜0.05），隨時間延長表達量增加。各組IL-12水平則無明顯改變（P＞0.05）。見表1。

四、流式細胞儀檢測RAW264.7與B16F10共培養后CD206的變化

圖1 Western印跡檢測RAW264.7細胞與B16F10細胞共培養不同時間后CD163的變化 1：空白對照組；2～4：分別為共培養24 h、48 h、72 h； 5：陽性對照組

圖2 Western印跡檢測RAW264.7基因RBP-Jk沉默前后與B16F10共培養不同時間后CD163蛋白的變化 1：空白對照組；2～4：分別為RBP-Jk沉默前共培養24、48、72 h； 5 ～ 7：分別為RBP-Jk沉默后共培養 24、48、72 h

表1 RAW264.7細胞與B16F10細胞共培養不同時間CD163相對表達量及IL-10、IL-12表達量、CD206熒光值的變化（±s）

表1 RAW264.7細胞與B16F10細胞共培養不同時間CD163相對表達量及IL-10、IL-12表達量、CD206熒光值的變化（±s）

組別 CD163 IL-10（ng/L） IL-12（ng/L） CD206熒光值空白對照組 1.032±0.070 80.577±3.119 35.207±0.905 4.117±0.351 RBP-Jk沉默前24 h 2.235±0.110 167.610±3.527 36.617±1.599 13.063±0.805 48 h 3.243±0.091 433.433±5.558 35.883±1.414 20.630±1.555 72 h 4.259±0.160 679.673±8.101 37.207±2.258 26.947±1.095 RBP-Jk沉默后24 h 0.683±0.029 63.403±0.856 35.400±0.805 4.773±0.763 48 h 0.961±0.065 103.427±2.072 33.377±1.109 5.397±0.476 72 h 1.340±0.104 202.297±3.610 33.683±1.293 9.600±0.570 F值 8.85 8.01 1.85 8.82 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05自由度（n） 1.021 1.012 2.000 1.083

圖3 流式細胞儀檢測RAW264.7基因RBP-Jk沉默前后與B16F10共培養不同時間后CD206的變化 3a：對照組；3b～3d：RBP-Jk沉默前共培養 24、48、72 h； 3e ～ 3f：RBP-Jk沉默后共培養 24、48、72 h

圖4 RT-PCR法檢測RAW264.7基因RBP-Jk沉默前后與B16F10共培養Notch信號通路相關基因mRNA的變化 M：標準參照物；1～3：分別為對照組、沉默前、沉默后的內參（GAPDH），352 bp； 4 ～ 6：分別為以上3組的Notch1，562 bp； 7 ～ 9：分別為以上3組的 Notch2，372 bp；10～12：分別為以上3組的DLL1，638 bp；13～15：分別為以上3組的DLL4，251 bp；16～18：分別為以上3組的Hes1，446 bp

表2 RAW264.7細胞與B16F10細胞共培養Notch信號通路相關基因mRNA的變化（與GAPDH的比值，±s）

表2 RAW264.7細胞與B16F10細胞共培養Notch信號通路相關基因mRNA的變化（與GAPDH的比值，±s）

注：n=2

組別 Notch1 Notch2 DLL1 DLL4 Hes1空白對照組 0.467±0.021 0.490±0.036 0.297±0.015 0.263±0.025 0.380±0.010 RBP-Jk沉默前 0.767±0.025 0.927±0.031 0.540±0.017 0.557±0.032 0.730±0.020 RBP-Jk沉默后 0.243±0.015 0.280±0.040 0.207±0.015 0.193±0.025 0.253±0.015 F值 477.41 255.50 349.09 145.41 748.14 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

經重復測量方差分析及線性趨勢檢驗，沉默后與沉默前共培養組比較，CD206表達量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；且在兩組內部，CD206的表達量在不同時間點成線性趨勢（n=1，F=20.362，P=0.006），隨時間延長表達量增加。見表1、圖3。

五、RT-PCR法檢測RAW264.7與B16F10共培養Notch信號通路相關基因mRNA的變化

單因素方差分析及兩兩比較結果顯示，空白對照組、沉默前及沉默后組 Notch1、Notch2、DLL1、DLL4、Hes1相對表達量差異有統計學意義（P＜0.01），且在沉默前共培養組的相對表達量均較空白對照組升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而在沉默后共培養組的相對表達量則較沉默前共培養組下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖4。

討 論

M1型巨噬細胞由脂多糖（LPS）及干擾素γ（IFN-γ）誘導，產生誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及細胞因子如腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、IL-1、IL-6 及高水平的IL-12等，而M2型巨噬細胞則由IL-4、IL-10及IL-13誘導，分泌轉化生長因子β（TGF-β）、IL-1受體拮抗劑及高水平的IL-10等。巨噬細胞分泌的IL-12與IL-10的比例是區分M1及M2型的關鍵［6］。另外，M1 型巨噬細胞還表達 CD16、CD32、iNOS，M2 型巨噬細胞的標志為 CD206、CD163［7］。Notch信號通路是由Notch配體、受體及下游信號轉導分子及調節分子構成。哺乳動物Notch受體包 括 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，配 體 包 括Delta-like1、3、4（DLL1、3、4）及Jagged1、2（Jag1、2）［8］。Notch 受體活化后通過DNA結合蛋白CBF1/RBP-J發揮效應，Notch信號激活HES轉錄因子，引起HES靶基因的抑制。有研究表明，Notch信號通路的活化促使巨噬細胞向M1型極化，并抑制向M2型極化，RBP-J介導的Notch信號通路在巨噬細胞極化中起重要的作用［3］。

研究表明，巨噬細胞與乳腺癌或卵巢癌細胞體外共培養能夠增加腫瘤細胞的侵襲性［9］，那么，共培養體系中腫瘤細胞對于巨噬細胞會有何種影響呢？Hagemann等［10］的研究發現，卵巢癌細胞與巨噬細胞共培養后能夠使巨噬細胞向具有TAM特性的表型分化。本研究采用小鼠單核巨噬細胞RAW264.7和小鼠黑素瘤細胞B16F10共培養，免疫印跡法及ELISA檢測結果顯示，隨共培養時間延長，RAW264.7細胞CD163表達量及上清IL-10水平逐漸增多，而上清IL-12水平無明顯改變。提示體外共培養體系中腫瘤細胞可使周圍的巨噬細胞向M2型極化。CBF1/RBP-J是活化Notch信號通路的重要蛋白，通過設計針對小鼠RBP-Jκ基因的siRNA編碼序列，并轉染至巨噬細胞內達到沉默Notch信號通路的目的。Notch信號通路沉默后共培養，ELISA示IL-12水平無顯著改變（P＞0.05），沉默后巨噬細胞向M1型分化未受明顯影響；IL-10表達量較未沉默時降低（P＜0.05），但水平仍高于IL-12；免疫印跡法及流式細胞儀檢測示巨噬細胞CD163及CD206表達較未沉默時減少。提示RAW264.7細胞Notch信號通路沉默后與腫瘤細胞共培養向M2型分化有所減少，但總體表型仍為M2型。既往有研究顯示，Notch信號通路的活化促使巨噬細胞向M1型極化，抑制向M2型極化［3］，依此進行理論上的推斷，抑制Notch信號通路可能促進向M2型極化并抑制向M1型極化。但重復實驗并未出現推斷的結果，M2型極化并未增多，而M1型極化亦無顯著減少。分析出現此結果的原因可能有以下兩方面：①Notch信號通路沉默后的共培養體系中RAW264.7細胞出現了除M1及M2型以外其他型別的分化，具體尚待進一步研究驗證。Mosser等［11］認為，巨噬細胞呈現出的表型不固定，而是由特定的表型以不同的比例混合而成，從而表現出不同的活化狀態，其極化具有復雜性和多樣性；②除Notch信號通路外，可能還有其他信號通路影響著共培養體系中巨噬細胞的極化，如文獻中報道的JAK/STAT途徑［12］，M2分化成熟的轉錄調節途徑（KLF4 的轉錄調節［13］，PPARs的轉錄調節［14］）以及 Jmjd3 的表觀遺傳學調節途徑［15］。RTPCR法檢測沉默前后共培養Notch信號通路相關基因mRNA的變化，結果顯示，沉默前共培養RAW264.7細胞Notch信號通路活化程度較單獨培養RAW264.7細胞增高，但沉默前共培養巨噬細胞表型為M2型，而非M1型，與“Notch信號通路的活化促使巨噬細胞向M1型極化并抑制向M2型極化”并不一致。沉默后共培養巨噬細胞表型雖然仍為M2型，但數量較沉默前有所減少，Notch信號通路的阻斷并未促進共培養后巨噬細胞向M2型分化。Notch信號通路在TAM極化過程中到底起了何種作用？為進一步探討Notch信號通路在腫瘤細胞對巨噬細胞極化的影響中的作用，下一步的實驗計劃過度活化該通路，觀察該狀態下巨噬細胞與腫瘤細胞共培養后的極化情況。

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2013-12-23）

（本文編輯：顏艷）

Effect of the Notch-RBP-J signaling pathway on the polarization of RAW264.7 murine macrophage-like cells cocultured with B16F10 murine melanoma cells

Wu Qiong,Chen Hao,Zhou Wuqing,Li Amei,Lyu Yalin,Hu Bin,Jiang Yiqun,Sun Jianfang.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s；Jiang Yiqun,Email；yiqunjiang@qq.com；Sun Jianfang,Email；sunjf57@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of the Notch-RBP-J signaling pathway on the phenotypic differentiation of RAW264.7 murine macrophage-like cells cocultured with B16F10 murine melanoma cells.MethodsA small interference RNA （siRNA）targeting the CBF1/RBP-Jκ gene was designed.RAW264.7 murine macrophage-like cells were divided into four groups；unsilenced co-culture group cocultured with B16F10 cells,silenced co-culture group transfected with the designed siRNA and cocultured with B16F10 cells,blank control group cultured alone,positive control group induced by interleukin-4 （IL-4）.After additional culture for different durations,Western blot,enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and flow cytometry were conducted to determine the phenotype of macrophages,and reverse transcription （RT）-PCR was performed to detect the expressions of notch1,notch2,DLL1,DLL4 and Hes1 genes in macrophages.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance （ANOVA）,repeated measures ANOVA,linear trend test and the Bonferroni method with the SPSS17.0 software.ResultsWestern blot showed that the relative expression level of CD163 in RAW264.7 cells was 1.016±0.018 in the blank control group,1.274±0.034,2.065±0.094 and 3.615±0.144 in the unsilenced co-culture group at 24,48 and 72 hours respectively,and 3.099±0.071 in the positive control group,with significant differences between these groups （n=4,F=527.42,P＜ 0.01）.There was a significant increase in CD163 expression in RAW264.7 cells in the unsilenced co-culture group compared with the blank control group.As ELISA revealed,the levels of IL-10 in the culture supernatant of RAW264.7 cells were（167.61±3.527）,（433.433 ± 5.558） and（679.673 ± 8.101） ng/L in the unsilenced co-culture group at 24,48,and 72 hours respectively,significantly higher than those in the silenced co-culture group（（63.403 ± 0.856）,（103.427 ± 2.072）,（202.297 ± 3.61） ng/L,respectively,F=8.01,P＜ 0.05）.Western blot and flow cytometry both demonstrated a statistical reduction in the expressions of CD163 and CD206 in RAW264.7 cells in the silenced co-culture group compared with the unsilenced co-culture group（bothP ＜ 0.05）.The mRNA expressions of notch signaling pathwayrelated genes in RAW264.7 cells were also attenuated in the silenced co-culture group in comparison with the unsilenced co-culture group.ConclusionsAlthough most of the RAW264.7 cells in the silenced co-culture group exhibited the M2 phenotype,their polarization toward M2 phenotype was weakened compared with those in the unsilenced co-culture group,implying that the activation of the Notch-RBP-J signaling pathway promotes the M2-polarization of RAW264.7 cells.

Notch-RBP-J signaling pathway；Macrophage polarization；Coculture techniques

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.001

國家自然科學基金（81102067）；中國醫學科學院北京協和醫學院青年基金（5201-01-6068）

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所

姜祎群，Email：yiqunjiang@qq.com；孫建方，Email：sunjf57@163.com