白念珠菌對人THP-1細胞產生白細胞介素6、活化信號分子IκBα的影響

楊海平 杜蕾蕾 曾榮 段志敏 沈永年 胡素泉 劉維達 陳青 李岷

白念珠菌對人THP-1細胞產生白細胞介素6、活化信號分子IκBα的影響

楊海平 杜蕾蕾 曾榮 段志敏 沈永年 胡素泉 劉維達 陳青 李岷

目的探討白念珠菌對人急性單核細胞白血病細胞系（THP-1細胞系）分泌白細胞介素6（IL-6）和細胞內信號分子NF-κB抑制蛋白（IκBα）激活的影響。方法實時熒光定量PCR分析105、106CFU/ml滅活白念珠菌刺激THP-1細胞IL-6 mRNA表達水平變化，酶聯免疫吸附法檢測IL-6分泌量。免疫印跡法分析白念珠菌體外作用THP-1細胞后不同時間IκBα和磷酸化IκBα的水平。結果105CFU/ml白念珠菌刺激THP-1 細胞后 1、3、6 h，IL-6 mRNA 水平（2-ΔΔCt）分別為 1.48 ± 0.06、6.48 ± 0.30、125.34 ± 1.47，刺激 3 h、6 h 后明顯高于空白對照組（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平分別為2.96± 0.35、8.57± 1.27、588.10± 2.31，與空白對照組比較，P值分別為0.036、0.001、 ＜ 0.001。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細胞后24 h，IL-6蛋白水平為（924.9±30.13）ng/L，與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌作用THP-1細胞后30 min、60 min,磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高，而IκBα蛋白水平相應降低。結論人THP-1細胞體外與白念珠菌作用后激活信號分子NF-κB并分泌IL-6，參與抗念珠菌感染固有免疫反應。

念珠菌，白色；白血病，單核細胞，急性；白細胞介素6；I-κB蛋白質類；NF-κB

白念珠菌是引起淺部、深部念珠菌病的最常見病原真菌。侵襲性念珠菌病是院內真菌感染最主要的死因，而白念珠菌是最常見的致病念

珠菌［1］。宿主單核巨噬細胞作為固有免疫中重要反應細胞，能識別并清除入侵的白念珠菌［2］。本研究旨在探討白念珠菌能否激活人急性單核細胞白血病細胞系細胞（THP-1）的信號分子 NF-κB抑制蛋白（IκBα），誘導白細胞介素6（IL-6）的分泌。

材料和方法

1.細胞、菌株、主要試劑：白念珠菌由中國微生物菌種保藏管理委員會醫學真菌中心提供，56℃30 min水浴滅活后，配制成不同濃度菌懸液待用。人THP-1細胞株購自美國American Type Culture Collection（ATCC）。兔抗人 IκBα 和磷酸化 IκBα 抗體為美國Cell Signaling Technology公司產品。IL-6酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒為欣博盛公司產品。PrimeScript RT Master Mix逆轉錄酶試劑盒為日本TaKaRa公司產品。iTaq Universal SYBR Green Supermix為美國Bio-rad公司產品。巴豆酯（PMA）、脂多糖（LPS）為美國Sigma公司產品。

2.細胞培養：人THP-1細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養、傳代。將細胞制備成105/ml細胞懸液，接種于12孔細胞培養板每孔1 ml及6孔細胞培養板每孔2 ml，加入100 μg/L PMA刺激48 h后，予不同濃度白念珠菌共培養。

3.實時熒光定量逆轉錄PCR：終濃度為105CFU/ml和106CFU/ml白念珠菌與2×105/ml THP-1共孵育，并設陽性刺激物 LPS（100 μg/L）組、培養基空白對照組。TRIzol法抽提總RNA，按PrimeScript RT Master Mix逆轉錄酶試劑盒說明書將1 μg總RNA反轉錄為cDNA。使用ABI 7300 PCR儀，采用Syber green法對目的基因進行擴增。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的變化水平，ΔCt=目的基因-內參照（β肌動蛋白）；某一樣品的ΔΔCt=某一樣品ΔCt-對照組樣品的ΔCt。相關基因引物見表1。

4.Western印跡分析：白念珠菌懸液（106CFU/ml）作用的THP-1細胞，裂解細胞，提取總蛋白。等量蛋白的不同樣品梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至聚偏二氟乙烯膜上。5%BSA封閉2 h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST液洗膜3次后，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG第二抗體反應2 h，TBST液洗膜3次，Supersignal試劑顯色發光，檢測IκBα和磷酸化IκBα的水平。

表1 實驗所用引物序列

表2 白念珠菌對人THP-1細胞株白細胞介素6 mRNA水平的影響

5.ELISA法：刺激THP-1細胞后24 h，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測IL-6含量。

結 果

1.白念珠菌對IL-6 mRNA水平的影響：刺激后1、3和6 h，不同濃度白念珠菌組、LPS組、空白對照組的IL-6 mRNA水平的變化情況的見表2。105CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細胞后3、6 h，IL-6 mRNA水平明顯高于空白對照組（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1細胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平與空白對照組比較，P值分別為0.036、0.001、＜0.001。

2.白念珠菌對IL-6蛋白分泌的影響：根據實時定量PCR結果，選取白念珠菌刺激效果較好的濃度106CFU/ml刺激后24 h，白念珠菌組、LPS組、空白對照組的上清液中IL-6濃度的分別為（924.90±30.13）、（286.10± 6.12）、（10.47±0.07）ng/L， 白念珠菌組與空白對照組比較差異有統計學意義（均P＜0.01）。

圖1 免疫印跡法分析白念珠菌體外作用THP-1細胞后不同時間IκBα和磷酸化IκBα的水平 1：空白對照組；2：作用30 min；3：作用 60 min

3.白念珠菌對THP-1細胞IκBα激活的影響：刺激后30 min，磷酸化IκBα蛋白水平已有升高，60 min時磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高；IκBα蛋白水平則相應有所降低。提示白念珠菌能夠激活THP-1細胞信號分子IκBα。見圖1。

討 論

固有免疫反應在抗白念珠菌感染中發揮重要作用，中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞作為主要的固有免疫細胞，構成抗感染免疫反應的第一道防線［3-4］。IL-6為主要的前炎癥因子之一，可由單核細胞、巨噬細胞等多種骨髓來源的免疫細胞以及各種上皮細胞、血管內皮細胞分泌，在抗感染炎癥反應的早期階段通過誘導產生急性時相反應蛋白來發揮重要作用；在炎癥后期，可招募單核、巨噬細胞聚集至感染局部，并能促進中性粒細胞凋亡以避免其過度分泌各種活性酶導致的組織損傷［5-7］。

早期研究發現，與正常小鼠相比，IL-6基因缺陷小鼠對系統性或經消化道感染的白念珠菌更為敏感，中性粒細胞數量遠低于正常小鼠，感染后其數量也未增多。IL-6缺失會引起念珠菌感染小鼠出現先天性防御反應缺陷，如中性粒細胞功能減低以及產生IL-10對巨噬細胞活性的抑制效應，這一系列反應最終導致IL-6缺陷小鼠不能產生Th1型保護反應，出現以IL-10高表達為特征的Th2型損傷性免疫反應［8］。

本研究初步發現，105、106CFU/ml白念珠菌作用THP-1細胞后，上調IL-6 mRNA水平均出現時間依賴效應，在刺激后3 h出現上升，刺激后6 h，105CFU/ml白念珠菌組mRNA水平為3 h的19倍，106CFU/ml組則升高59倍。本研究采用LPS（TLR4受體的配體）作為激活THP-1細胞的陽性對照物，也能誘導出相同的時間依賴效應，刺激6 h后IL-6 mRNA水平比3 h組上升77倍。

刺激后3 h，105CFU/ml組IL-6 mRNA水平為6.48± 0.30，106CFU/ml組為 8.57± 1.27，后者為前者的1.32倍。刺激后6 h，兩組分別為125.34±1.47和588.10±2.31，高濃度白念組為低濃度組的4.7倍，提示白念珠菌上調IL-6 mRNA水平為劑量依賴效應。

本研究結果表明，106CFU/ml作用THP-1細胞24 h后，上清液中IL-6含量為（924.90±30.13）ng/L，與空白對照組（10.47±0.07 ng/L）比較，明顯上升，表明白念珠菌不僅能在mRNA水平誘導THP-1細胞上調IL-6轉錄，而且在蛋白水平增強該因子的分泌。

NF-κB作為一種轉錄因子在調控前炎癥因子轉錄表達中起重要作用，在無外界刺激因素時，該因子主要由p50和p65亞單位組成，與NF-κB抑制蛋白（IκBα）結合成復合體，在細胞質中處于失活狀態。當細胞接受適宜刺激后，IκB激酶復合體可使IκBα 磷酸化和降解， 導致 NF-κB p50、p65二聚體與IκBα解離，該二聚體隨后移位入核，結合到NF-κB特異的DNA結合位點，從而調控相應的基因轉錄表達［9-10］。本實驗結果表明，白念珠菌刺激后30 min已出現IκBα蛋白磷酸化，60 min時IκBα磷酸化水平顯著升高，而對應的IκBα水平有所降低，提示白念珠菌可誘導THP-1細胞中作為NF-κB p50、p65二聚體抑制劑的IκBα分子出現活化，其對NF-κB抑制效應隨之降低，最終導致后者移位入核，調節IL-6等前炎癥因子的轉錄。

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2014-01-26）

（本文編輯：顏艷）

Effect ofCandida albicanson the production of interleukin-6 by and activation of IκBα in human THP-1 monocytes

Yang Haiping*,Du Leilei,Zeng Rong,Duan Zhimin,Shen Yongnian,Hu Suquan,Liu Weida,Chen Qing,Li Min.*454th Hospital of PLA,Nanjing 210002,China

s；Li Min,Email；drlimin@sina.cn；Chen Qing, Email；qngchen@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect ofCandida albicanson the production of interleukin-6 by and activation of IκBα in an acute monocytic leukemia cell line THP-1.MethodsTHP-1 cells were classified into three groups to be stimulated by heat-killedC.albicanscells in concentrations of 105and 106colony-forming units（CFU）/ml and lipopolysaccharide （100 μg/L） in vitrorespectively.Those remaining untreated served as the blank control group.After additional culture for different durations,real time reverse transcription PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were performed to measure the mRNA and protein expression levels of interleukin-6（IL-6）respectively,and Western blot was conducted to determine the levels of total and phosphorylated IκBα.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsA significant increase was observed in the mRNA expression level（2-ΔΔCt）of IL-6 in THP-1 cells at 3 and 6 hours after starting treatment withC.albicansat 105CFU/ml（6.48±0.30 vs.0.84±0.16,125.34±1.47 vs.1.22±0.22,bothP＜0.01）,and at 1,3 and 6 hours after starting treatment withC.albicans at 106CFU/ml（2.96±0.35 vs.1.03±0.16,8.57±1.27 vs.0.84±0.16,588.10±2.31 vs.1.22±0.22,P＜0.05 or 0.01）compared with the blank control group,but no significant difference was noted between THP-1 cells at 1 hour after starting treatment withC.albicansat 105CFU/ml and those remaining untreated（1.48±0.06 vs.1.03±0.16,P ＞ 0.05）.The protein expression level of IL-6 was （924.9 ± 30.13） ng/L in THP-1 cells at 24 hours after starting treatment withC.albicansat 106CFU/ml,significantly different from that in the blank control group（P＜0.001）.There was a marked elevation in the level of phosphorylated IκBα protein,but an obvious reduction in the level of IκBα protein in THP-1 cells treated withC.albicansat 106CFU/ml for 30 and 60 minutes.ConclusionHuman THP-1 monocytes may play a role in innate immune responses againstC.albicansthrough activation of nuclear factor-κB and production of IL-6.

Candida albicans；Leukemia,monocytic,acute；Interleukin-6；I-kappa B proteins；NF-kappa B

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.010

國家自然科學基金（81371750、81101734）；江蘇省自然科學基金（BK2011128）

210002南京，解放軍454醫院（楊海平）；中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所、江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室（杜蕾蕾、曾榮、段志敏、沈永年、胡素泉、劉維達、李岷）；江蘇省血液中心（陳青）

李岷，Email：drlimin@sina.cn；陳青，Email：qngchen@hotmail.com