銀屑病患者皮膚中原位記憶T淋巴細胞的檢測

欒超 楊永紅 王焱 劉毅 陳敏 蔣明軍 王寶璽

銀屑病患者皮膚中原位記憶T淋巴細胞的檢測

欒超 楊永紅 王焱 劉毅 陳敏 蔣明軍 王寶璽

目的研究皮膚組織原位記憶T淋巴細胞在銀屑病發病過程中的作用。方法收集32例進行期斑塊狀銀屑病患者的臨床資料，采集每例患者的皮損和非皮損組織、9例患者皮損消退后皮膚標本；10例健康人皮膚為對照。采用免疫組化法檢測組織原位記憶T淋巴細胞的特征性表面標志CD69和CD103，分析組織原位記憶T淋巴細胞在銀屑病發病不同時期的情況。兩組免疫組化結果進行t檢驗。結果32例進行期銀屑病患者皮損和非皮損每高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細胞數量分別為11.34±7.60和2.72±4.20，皮損區明顯高于非皮損區（t=8.46，P＜0.01）；其中9例患者皮損消退前后每高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細胞數量分別為14.33±2.21和12.00±4.58，皮損消退前后比較差異無統計學意義（t=1.98，P=0.08）；健康對照組為1.70±2.98，與銀屑病患者非皮損區比較，差異無統計學意義（t=0.71，P＞0.05）。結論銀屑病患者皮膚中原位記憶T淋巴細胞可能在皮損的形成和復發過程中起作用。

銀屑病；記憶T淋巴細胞，原位

最近有研究發現，病毒感染皮膚后，皮膚中停留少量的特殊記憶T淋巴細胞亞群，對同類病毒再次感染起防御作用，不同于中心記憶T淋巴細胞（TCM） 和效應記憶T淋巴細胞（TEM），這群CD69+CD103+T淋巴細胞被命名為組織原位記憶T淋巴細胞（TRM）［1-2］。TRM細胞是最近新發現的一群特殊的記憶T細胞，炎癥結束后不會凋亡，能長期存活于周圍組織中。TRM細胞分化更為完全，不依賴于循環記憶T細胞的補充，能夠長期定居在周圍組織中。TRM細胞的數量不隨炎癥細胞的增多而增加，在感染和腫瘤免疫中發揮重要作用［1-5］。銀屑病是T淋巴細胞介導的慢性炎癥性疾病，易于反復發作。有研究提示，患者皮膚居住細胞可能在該病反復發作過程中起重要作用［6-7］，但對其細胞類型和致病機制卻知之甚少。隨著近年來一些T淋巴細胞新亞群的發現，認識到記憶T淋巴細胞在該病復發過程中的作用［8-9］。我們推測TRM細胞可能在銀屑病的發病機制，尤其在復發過程中起重要作用。本文運用免疫組化法檢測了銀屑病患者皮損、非皮損和消退后皮膚中TRM細胞的情況，研究TRM細胞在銀屑病發病機制中的作用。

資料和方法

一、資料

1.標本：32例進行期斑塊狀銀屑病患者來源于2013年9月至2014年1月我院門診患者，經臨床和組織病理確診為銀屑病，男19例，女13例，年齡19～56歲，病程1個月至20年，銀屑病嚴重程度指數（PASI）3.8～46。皮膚鉆孔法采集同一患者軀干部皮損區和非皮損區皮膚標本、9例皮損消退后皮膚標本。10例健康人對照皮膚來源于我院皮膚外科整形手術多余的軀干部正常皮膚，男6例，女4例，年齡18～49歲。銀屑病患者和健康人對照組的性別比例和年齡差異無統計學意義。本研究經本院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

2.試劑：鼠抗人CD69單克隆抗體和兔抗人CD103單克隆抗體均由沙特阿拉伯Abcom公司生產，分別按1∶25和1∶500稀釋，磷酸鹽緩沖液（PBS）由美國Gibco公司生產。枸櫞酸抗原修復緩沖液、內源性過氧化氫酶抑制劑、非免疫動物血清（羊）、HRP標記抗羊鼠IgG、HRP標記抗兔 IgG、DAB顯色試劑盒、蘇木素和中性樹膠均由福州邁新生物技術有限公司生產。

二、方法

1.免疫組化：所有標本經甲醛液固定，將組織制成蠟塊后連續切成5 μm薄片，免疫組化染色按照染色試劑盒操作說明進行，所有切片均在同一質控條件下進行，設陽性和陰性對照。其中，雙染色為DAB與AEC染色，CD69使用DAB染色，陽性為棕色，CD103使用AEC染色，陽性為紅色。

2.結果判定：CD69陽性表達定位于細胞膜，CD103陽性表達定位于細胞膜和胞質，單染結果均為棕黃色顆粒。在同一切片上CD69（棕色）和CD103（紅色）同時染色，即同時表達CD69和CD103的T淋巴細胞見紅棕色顆粒。計算5個顯微鏡高倍視野下陽性表達T淋巴細胞平均個數。

3.數據處理：采用SPSS13.0軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 銀屑病皮損CD69和CD103連續切片同部位單染結果表皮和真皮均有CD69+T淋巴細胞和CD103+T淋巴細胞，見棕黃色顆粒（1a：CD69×100；1b：CD103×100）

圖2 銀屑病皮損CD69（棕色）和CD103（紅色）雙染色結果CD69+CD103+T淋巴細胞見紅棕色顆粒（2a：×100；2b：×200）

結 果

32例銀屑病患者皮損（圖1）和非皮損、9例皮損消退后皮膚和10例正常人對照皮膚中均可見單獨表達CD69和CD103的T淋巴細胞，分布較廣泛，包括表皮和淺深層真皮。32例銀屑病患者皮損中可見CD69+CD103+T淋巴細胞，分布于表皮和真皮淺層（圖2）；9例皮損消退后皮膚中CD69+CD103+T淋巴細胞主要分布于表皮；僅有13例銀屑病患者非皮損和3例健康人對照皮膚中見CD69+CD103+T淋巴細胞，分布于真皮淺層。

進行期銀屑病患者皮損（32例）和非皮損（13例）每個顯微鏡高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細胞數量分別為11.34±7.60和2.72±4.20，皮損明顯高于非皮損（t=8.46，P＜ 0.01）；健康人對照皮膚（10例）為1.70±2.98，與32例銀屑病非皮損比較，差異無統計學意義（t=0.71，P＞0.05）。銀屑病患者PASI評分與皮損中CD69+CD103+T淋巴細胞數量正相關（r=0.75，P＜ 0.01）。

32例銀屑病患者中的9例患者皮損消退前后每高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細胞數量分別為14.33±2.21和12.00±4.58，皮損消退前后比較差異無統計學意義（t=1.98，P=0.08）。9例患者消退后皮膚中CD69+CD103+T淋巴細胞數量明顯高于10例健康人對照皮膚（t=5.87，P＜0.01）。9例患者PASI評分與皮損消退后皮膚中CD69+CD103+T淋巴細胞數量正相關（r=0.89，P＜ 0.01）。

討 論

普遍認為銀屑病是多基因遺傳背景下主要由Th17和Th1細胞介導的免疫異常性疾病，T淋巴細胞在該病發病機制中起中心作用。有研究［6-7］通過移植銀屑病患者發病時非皮損處皮膚到特定小鼠建立模型，發現非皮損處皮膚仍能發展成銀屑病皮損，提示銀屑病患者皮膚中的居住細胞可能在該病發生過程中起著重要作用。

TRM細胞與TCM和TEM具有不同的表型和功能，在周圍組織的定位需要組織局部微環境和黏附分子的參與。組織歸巢T淋巴細胞表達歸巢受體CCR9和α4β7整合素，當T淋巴細胞到達周圍組織后CCL25和轉化生長因子α（TGF-α）誘導歸巢T淋巴細胞表達E鏈（CD103），與β7鏈重新整合，使T淋巴細胞在組織中定居［10］。此外，細胞因子可促進CD69表達缺失的T淋巴細胞遷移，CD69可使T淋巴細胞定位于局部組織［11-12］。CD69和CD103是TRM細胞的特征性表面標志。

銀屑病皮損消退后是否有抗原特異性TRM繼續停留？在該病復發過程中起何作用？我們的研究發現，銀屑病患者皮損中CD69+CD103+T淋巴細胞的數量明顯高于非皮損，表明 CD69+CD103+T淋巴細胞的數量與皮損的形成有關。易于反復發作是銀屑病的特點，也是治療難點，其機制目前還不清楚。本研究發現，銀屑病患者皮損消退后表皮中仍然存在相當數量的CD69+CD103+T淋巴細胞，提示TRM細胞可能與該病皮損的復發有關。但本研究中銀屑病患者皮損消退后皮損獲得困難，樣本量較小，需要擴大樣本量研究。此外，本研究發現，銀屑病非皮損處CD69+CD103+T細胞數量與健康人皮膚無明顯差異，部分解釋了外周循環來源的活化T細胞是否導致皮損還取決于皮膚中居住T細胞的分布情況。

由于通過免疫組化方法同時檢測三種表面標記存在困難，本研究沒有區別皮膚中的CD69+CD103+T淋巴細胞是屬于CD4+T淋巴細胞還是CD8+T淋巴細胞亞群。有研究發現，銀屑病患者臨床痊愈后皮膚中主要是CD8+T淋巴細胞［13］，推測銀屑病皮損消退后留下的主要是CD8+TRM細胞。近期的研究也發現，皮膚在HSV-1感染后留下的CD8+TRM細胞可以直接被再次感染的同類病毒抗原激活，TRM細胞活化閾值較低，其發揮免疫作用可以不需要CD4+T淋巴細胞和B細胞的參與［1］。因此，銀屑病患者皮膚中的TRM細胞的種類、功能和活化機制還需要進一步深入研究。

志謝本院皮膚整形美容外科和門診治療室在標本收集過程中的大力支持

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2014-02-05）

（本文編輯：顏艷）

Detection of tissue-resident memory T lymphocytes in patients with psoriasis

Luan Chao,Yang Yonghong,Wang Yan,Liu Yi,Chen Min,Jiang Mingjun,Wang Baoxi.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs；Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

；Chen Min,Email；drchenmin@126.com

ObjectiveTo investigate the role of tissue-resident memory T lymphocytes in the pathogenesis of psoriasis.MethodsClinical information was collected from 32 patients with progressive plaque psoriasis.Tissue specimens were obtained from both lesional and nonlesional psoriatic skin of all the patients,as well as from faded lesions in 9 of these patients.Tissue specimens from the normal skin of 10 healthy individuals served as the controls.Immunohistochemical staining was performed to detect the two characteristic surface markers CD69 and CD103 on tissue-resident memory T lymphocytes and to analyze the status of these T lymphocytes at different stages of psoriasis.The results of immunohistochemical staining were compared byttest.ResultsThe mean number of CD69+CD103+T lymphocytes per high-power field was significantly higher in lesional skin than in nonlesional skin of the 32 patients（11.34±7.60 vs.2.72±4.20,t =8.46,P＜0.01）,but similar between psoriatic lesions in the 9 patients before and after subsidence（14.33±2.21 vs.12.00±4.58,t =1.98,P=0.08）.There was no significant difference in the mean number of CD69+CD103+T lymphocytes between nonlesional psoriatic skin and normal control skin（2.72±4.20 vs.1.70±2.98,t =0.71,P＞0.05）.ConclusionTissue-resident memory T lymphocytes may play a role in the formation and recurrence of psoriatic lesions in patients.

Psoriasis；Memory T lymphocyte,resident

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.009

衛生公益性行業科研專項經費（201002016）

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院、江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室

陳敏，Email：drchenmin@126.com