羧甲基殼聚糖膜對(duì)人皮膚黑素細(xì)胞的生物相容性研究

孔玉龍 王克玉 張秀文 馬偉元

羧甲基殼聚糖膜對(duì)人皮膚黑素細(xì)胞的生物相容性研究

孔玉龍 王克玉 張秀文 馬偉元

目的探討羧甲基殼聚糖膜對(duì)健康人黑素細(xì)胞的生物相容性，探索羧甲基殼聚糖膜搭載黑素細(xì)胞的可行性。方法使用流延法聯(lián)合戊二醛交聯(lián)法制備羧甲基殼聚糖膜，黑素細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)分離培養(yǎng)健康人黑素細(xì)胞，使用HMB45染色、MTT法、NaOH裂解法、酪氨酸酶活性檢測(cè)等方法檢測(cè)羧甲基殼聚糖膜對(duì)黑素細(xì)胞功能的影響。結(jié)果倒置顯微鏡下觀察，黑素細(xì)胞在羧甲基殼聚糖膜上分布均勻，形態(tài)正常。免疫組化染色顯示，貼附于羧甲基殼聚糖膜的黑素細(xì)胞抗HMB45單克隆抗體染色陽(yáng)性。利用MTT法測(cè)定的黑素細(xì)胞增殖曲線顯示，羧甲基殼聚糖可以支持黑素細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，黑素合成量（A值為0.083±0.015）與培養(yǎng)皿所培養(yǎng)的黑素細(xì)胞（A值0.066±0.008）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.38，P＞0.01）；黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性（A值0.234±0.083）與培養(yǎng)皿培養(yǎng)的黑素細(xì)胞（A值0.241±0.061）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.23，P＞0.05）。結(jié)論羧甲基殼聚糖膜可以維持黑素細(xì)胞的正常功能，具有較好的生物相容性。

黑素細(xì)胞；殼聚糖；膜，人工；生物相容性材料

羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CM-chitosan）是殼聚糖的水溶性衍生物［1］，具有良好的組織相容性、可吸收性、無(wú)毒性、抗菌性及良好的成膜性等，在食物保鮮、制藥、傷口處理等方面已有廣泛應(yīng)用［2］。白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的后天性色素脫失性皮膚黏膜病，外科治療如鉆孔移植、負(fù)壓吸皰法、自體表皮培養(yǎng)移植、自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞懸液移植等已逐漸成為主要的治療方法［3-4］。其中自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞懸液移植可以較少的皮膚取材治療較大面積的皮損，但因細(xì)胞懸液的流動(dòng)性，往往導(dǎo)致黑素細(xì)胞不易在移植床部位定植而影響療效。我們利用羧甲基殼聚糖膜搭載黑素細(xì)胞，研究羧甲基殼聚糖膜對(duì)黑素細(xì)胞的生物相容性。

材料與方法

一、材料

羧甲基殼聚糖為青島弘海生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，M254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基、HMGS添加劑、胎牛血清等為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、左旋多巴為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；抗HMB45單克隆抗體為美國(guó)Zymed生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

二、方法

1.膜的制備：將羧甲基殼聚糖溶于雙蒸水中，配制成3%溶液，以500×g離心20 min，取上清液加入到培養(yǎng)板（6孔板、96孔板）中，60℃烘干，再將膜放入含0.5%戊二醛、3%冰醋酸、50%乙醇的混合溶液中交聯(lián)12 h，1%磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗3遍，每遍5 min，紫外線燈照射12 h，加入適量M254 浸泡 4 h 備用［5］。

2.黑素細(xì)胞的分離培養(yǎng)：取本院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后的皮膚標(biāo)本置于含有雙抗的PBS中浸泡備用。在超凈臺(tái)中切除周圍壞死的組織及皮下組織，將組織標(biāo)本切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，在培養(yǎng)皿中加入0.25%胰酶，將組織小塊的真皮面朝下浸于胰酶中，4℃消化過(guò)夜，吸去胰酶，PBS清洗2遍，將表皮與真皮分離，并將表皮用0.25%胰酶37℃消化30 min。加入10%血清終止消化，輕輕吹打成單個(gè)細(xì)胞。以200×g離心力5 min，棄上清，加入M254完全培養(yǎng)基10 ml，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，然后分裝到兩個(gè)25 cm培養(yǎng)瓶中。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，10 d后傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［6］。

3.細(xì)胞貼附情況觀察：將黑素細(xì)胞制成1×105/ml的細(xì)胞懸液。分別滴加到羧甲基殼聚糖膜的6孔板和普通6孔板內(nèi)，每孔中加2 ml，每3天換液1次，并在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼附情況。

4.細(xì)胞爬片制作及抗HMB45染色：將羧甲基殼聚糖按照上述方法制作到爬片上，將細(xì)胞調(diào)整到1×106/ml，分別種植到羧甲基殼聚糖膜的爬片和普通爬片上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，取出爬片，用4℃丙酮固定5 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，并封閉非特異性抗原。分別加入鼠抗人HMB45單克隆抗體及生物素標(biāo)記的第二抗體，然后加入現(xiàn)配的DAB試劑顯色，最后經(jīng)過(guò)沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

5.采用MTT法測(cè)定黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線：取16個(gè)96孔板，平均分成兩組，將羧甲基殼聚糖膜按上面的方法做到其中一組中，另一組培養(yǎng)板不做處理，在兩組96孔板上接種黑素細(xì)胞，每板選擇6個(gè)孔，細(xì)胞調(diào)整為 1 × 105/ml，接種后分別在 1、2、3、4、5、6、7、8 d時(shí)，分別取 1塊實(shí)驗(yàn)板和普通板，測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度（A），取平均值描繪出各自的生長(zhǎng)曲線。

6.NaOH裂解法檢測(cè)黑素含量：分別從羧甲基殼聚糖膜培養(yǎng)皿及普通培養(yǎng)皿中收集1×106個(gè)黑素細(xì)胞，分別加入0.2 ml雙蒸水使細(xì)胞懸浮1 min，然后加入500 μl乙醚和500 μl乙醇的混合物室溫下放置15 min，1 300×g離心5 min，棄上清，沉淀中加入 1 mol/L NaOH（含 10%DMSO）1.0 ml，于 80 ℃下30 min，加入4.0 ml雙蒸水，分光光度計(jì)下測(cè)量475 nm處的A值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［7］。

7.酪氨酸酶活性測(cè)定：將黑素細(xì)胞以5×104/孔分別接種于普通96孔板和羧甲基殼聚糖膜覆蓋的板，在37℃5%CO2下孵育。每隔2 d換1次培養(yǎng)基，孵育7 d后用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗1次，然后每孔加入1%TritonX-100溶液100 μl，超聲振蕩30 min后，每孔加入100 μl 0.1%左旋多巴溶液，于37℃下3 h，在酶標(biāo)儀475 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔A值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［7-8］。

結(jié) 果

一、黑素細(xì)胞貼附情況

接種在羧甲基殼聚糖膜上的黑素細(xì)胞分布均勻，培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，樹(shù)突數(shù)量有所增加，伸展良好充分，細(xì)胞形態(tài)與普通培養(yǎng)皿上黑素細(xì)胞形態(tài)相似（圖 1、2）。

二、HMB45染色后的情況

接種于羧甲基殼聚糖膜上的黑素細(xì)胞HMB45染色陽(yáng)性（圖 3、4）。

三、生長(zhǎng)曲線比較

生長(zhǎng)曲線顯示，黑素細(xì)胞可以在羧甲基殼聚糖膜上增殖，增殖趨勢(shì)與普通培養(yǎng)皿相近（圖5），總體趨勢(shì)略低于普通培養(yǎng)皿。

四、黑素含量、酪氨酸酶活性比較

羧甲基殼聚糖膜組黑素細(xì)胞內(nèi)黑素含量（A值）為0.083±0.015，普通培養(yǎng)皿組為0.066±0.008，兩組比較，t=2.38，v =38，P ＞ 0.01， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酪氨酸酶活性測(cè)定，羧甲基殼聚糖膜組為0.234±0.083，普通培養(yǎng)皿組為0.241±0.061，兩組比較，t=0.23，v=38，P ＞ 0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明羧甲基殼聚糖膜上的黑素細(xì)胞可以正常合成黑素。膜性、水溶性差等。

圖1 普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 d后的黑素細(xì)胞

圖2 羧甲基殼聚糖膜培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 d后黑素細(xì)胞

圖3 普通爬片上黑素細(xì)胞經(jīng)HMB45染色

圖4 羧甲基殼聚糖膜覆蓋的爬片上黑素細(xì)胞經(jīng)HMB45染色陽(yáng)性表現(xiàn)

圖5 噻唑藍(lán)法測(cè)定黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線黑素細(xì)胞可以在羧甲基殼聚糖膜上增殖，總體趨勢(shì)略低于普通培養(yǎng)皿

討 論

在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們選用了羧甲基殼聚糖作為黑素細(xì)胞的載體。將羧甲基殼聚糖直接加入培養(yǎng)板中，操作簡(jiǎn)單，便于消毒，易于細(xì)胞培養(yǎng)，并且羧甲基殼聚糖膜可以取出，質(zhì)地柔軟，可以緊密貼附在皮膚表面。研究結(jié)果顯示，黑素細(xì)胞可以很好的貼附于羧甲基殼聚糖膜表面，在膜上分布均勻，樹(shù)枝狀突起伸展充分，黑素細(xì)胞能很好地在膜上生長(zhǎng)、增殖。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，羧甲基殼聚糖膜能夠維持黑素細(xì)胞的正常酪氨酸酶活性及黑素合成的功能。表明羧甲基殼聚糖膜與黑素細(xì)胞具有良好的生物相容性，將來(lái)可作為一種新的搭載黑素細(xì)胞的材料，在大面積色素脫失性疾病治療方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。

近年來(lái)，自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植逐漸成為治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的重要方法，尤其是大面積患者。該方法主要是將培養(yǎng)的自體黑素細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，通過(guò)各種方法直接移植到色素脫失部位［9］。為了提高療效，有學(xué)者將透明質(zhì)酸添加到細(xì)胞懸液中，不僅增加了懸液的黏度，同時(shí)透明質(zhì)酸還可以促進(jìn)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［10］。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展延伸，有學(xué)者利用聚乳酸、羊膜、硅膠、殼聚糖等［11］材料構(gòu)建搭載轉(zhuǎn)移黑素細(xì)胞的載體，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到移植部位，取得一定進(jìn)展。但這些材料亦有其不足之處，如羊膜具有潛在的生物安全危害，殼聚糖成

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2014-02-14）

（本文編輯：顏艷）

Biocompatibility of carboxymethyl chitosan membranes with human skin melanocytes

Kong Yulong,Wang Keyu,Zhang Xiuwen,Ma Weiyuan.Department of Dermatology,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250012,China

；Wang Keyu,Email；wangkeyu@medmail.com.cn

ObjectiveTo study the biocompatibility of carboxymethyl chitosan （CMCS） membrane with melanocytes from healthy human skin,and to investigate the feasibility to transport and carry melanocytes by using CMCS membrane.MethodsCMCS membrane was prepared by a casting method combined with a glutaraldehydebased cross-linking method.Melanocytes were isolated from the foreskin of healthy men,and subjected to primary culture and subculture.The third-passage melanocytes were classified into two groups to be cultured on the CMCS membrane（test group） or traditional culture plates（control group）.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay was performed to evaluate the proliferative activity of melanocytes,and a sodium hydroxide-based lysis method to determine melanin content.HMB45 staining was conducted,and tyrosinase activity was estimated for melanocytes.ResultsInverted microscopy showed that melanocytes were evenly distributed on the CMCS membrane with a normal shape.The melanocytes adherent to the CMCS membrane stained positive for anti-HMB45 monoclonal antibody.The growth curve of the melanocytes on the CMCS membrane,which was obtained from MTT assay,demonstrated that CMCS membrane could support the normal growth of melanocytes.No significant difference was observed between the test group and control group in melanin content（0.083±0.015 vs.0.066±0.008,t=2.38,P＞0.01）or tyrosinase activity（0.234±0.083 vs.0.241±0.061,t=0.23,P＞0.05）.ConclusionCMCS membrane can maintain the normal biological activity of melanocytes and have good biocompatibility with skin melanocytes.

Melanocytes；Chitosan；Membranes,artificial；Biocompatible materials

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.007

山東省自然科學(xué)基金（Y2008C78）

250012濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科

王克玉，Email：wangkeyu@medmail.com.cn