組織蛋白酶B 在急性光損傷皮膚成纖維細胞中的表達及意義

侯巍 許慶芳 劉晨 鄭躍 賴維

組織蛋白酶B 在急性光損傷皮膚成纖維細胞中的表達及意義

侯巍 許慶芳 劉晨 鄭躍 賴維

目的探討組織蛋白酶B（CatB）在急性光損傷人皮膚成纖維細胞（HDF）中的表達變化及意義。方法體外培養原代HDF，選取第4～8代細胞進行實驗。實驗設長波紫外線（UVA）照射組和不照射的對照組。CCK8法分別檢測5、10、15、20和25 J/cm2UVA照射后HDF的增殖率。用10 J/cm2UVA單次照射致HDF急性光損傷，Western印跡及實時定量逆轉錄（RT）-PCR分別檢測急性光損傷組HDF及對照組HDF照射后24、48、72 h CatB 蛋白及 mRNA 表達；另外分別用 10、15、20、25 J/cm2UVA 照射 HDF，Western印跡及實時定量RT-PCR分別檢測急性光損傷組及對照組HDF照射后48 h CatB蛋白及基因表達。數據采用SPSS13.0統計軟件行方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD）。結果UVA照射導致HDF增殖率下降；當UVA劑量≤10 J/cm2時，細胞存活率均保持在85%以上，各照光組分別與對照組24、48、72 h時比較，均P＜0.05。Western印跡結果顯示，急性光損傷組（10 J/cm2UVA照射）CatB蛋白灰度值在照射后24 h（0.76±0.14）、48 h（1.34±0.38）、72 h（0.82±0.09）均較對照組（分別為0.35±0.01、0.45±0.12、0.61±0.06）升高（均P＜0.05）。實時定量RT-PCR顯示，在急性光損傷組CatB的mRNA表達在照射后24 h（0.149±0.009）、48 h（0.173±0.009）、72 h（0.185±0.158） 也較對照組（分別為0.089±0.015、0.091±0.010、0.111±0.017） 上調（均P＜0.05）。10、15、20、25 J/cm2UVA 照射HDF后 48 h，CatB的蛋白灰度值分別為 0.99 ± 0.07、1.49± 0.14、1.89 ±0.08、2.07±0.06，均較對照組（0.60±0.05）升高（均P＜0.05），CatB的mRNA表達也較對照組升高。結論UVA致急性光損傷的皮膚成纖維細胞中CatB蛋白及mRNA表達均上調。

成纖維細胞；紫外線；輻射損傷，實驗性；組織蛋白酶B

組織蛋白酶B（CatB）參與細胞遷移、增殖及凋亡等的調節，同時在細胞外基質重塑中也起到重要作用，參與皮膚損傷修復及瘢痕形成［1］。近年來的研究發現，除基質金屬蛋白酶（MMP）外，組織蛋白酶等其他的酶也參與皮膚光老化發生。在光老化的皮膚及細胞模型中，CatB的表達均已被證實發生改變［2］。但在急性光損傷中CatB的變化還鮮見報道。為進一步探索CatB在光損傷中的作用，我們研究長波紫外線（UVA）照射導致皮膚成纖維細胞急性光損傷后CatB的表達變化，觀察該變化在時間上的規律及與UVA劑量之間的關系。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細胞原代培養標本：來自中山大學附屬第三醫院泌尿外科門診健康兒童包皮環切術后包皮組織。本實驗經中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準。

2.主要試劑及儀器：DMEM（Dulbecco′s modified Eagle′s media）高糖培養基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、胰酶、青鏈霉素產自美國Gibco公司；CCK8試劑產自日本Dojindo公司；Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜產自美國Sigma公司。光源使用UVA輻射儀（美國Sigma公司，ss-03A）， 燈管為 Philips UVA TLl0RS，波長320～400 nm。UVA照射計產自上海希格瑪高科技有限公司。一抗兔抗人組織蛋白酶B多克隆IgG抗體、內參兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆IgG抗體、二抗辣根過氧化物酶（HRP）-羊抗兔 IgG產自美國 Cell Signaling Technology公司。全蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒產自中國凱基公司；ECL顯色試劑盒產自美國Millipore公司；預染蛋白標準品（marker）產自加拿大MBI Fermentas公司；Trizol產自美國Invitrogen公司；第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒、CatB引物、GAPDH引物產自日本TaKaRa公司。酶聯免疫檢測儀（美國BioTek公司），熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；ABI PRISM 7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

二、方法

1.皮膚成纖維細胞原代培養及UVA照射：取3～9歲小兒包皮，參照文獻［3］方法常規分離培養成纖維細胞。原代細胞達到80%～90%融合時，按1∶2傳代，3～4代細胞凍存。細胞復蘇后接種于培養皿，分為UVA照射組和不照射的對照組。當成纖維細胞生長達80%～90%融合時（即6×105個細胞/ml），照射組予以UVA單次照射，照射劑量分別為 5、10、15、20 和 25 J/cm2。照射時燈管距離培養皿的垂直距離為21 cm，相應空白對照組予以與照光時長相等的避光。照射完成后，加入新鮮培養液，將細胞置于95%濕度、5%CO2、37℃培養箱繼續培養至UVA照射后24、48和72 h，分別進行后續實驗。

2.細胞增殖活力檢測：各組細胞培養至相應時間后，CCK8法檢測細胞增殖率，檢測時每孔加入10 μl CCK8試劑，37℃孵育3 h，在酶聯免疫檢測儀上測定450 nm的吸光度A值。實驗重復3次。

3.Western印跡檢測CatB蛋白表達：各組細胞按實驗要求培養至相應時間后，按試劑盒操作提取細胞總蛋白，保存于-70℃冰箱，BCA法蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。電泳結束后轉印到PVDF膜，5%封閉液孵育 1 h。一抗兔抗人 CatB-IgG（濃度 1∶1 000），內參兔抗人 GAPDH-IgG（濃度 1∶1 000），4 ℃孵育過夜。吐溫三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗膜，二抗辣根過氧化物酶（HRP）-羊抗兔 IgG（濃度 1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜。將膜置于暗盒中，ECL顯色試劑盒A液及B液1∶1混合后孵育2～3 min，曝光，顯影，定影。所有實驗重復3次。Western印跡結果采用凝膠圖像處理系統ImageJ軟件分析CatB條帶的密度。

4.RT-PCR檢測CatB mRNA表達水平：各組細胞按實驗要求培養至相應時間后，用Trizol試劑提取RNA，焦碳酸二乙酯（DEPC）水作空白對照，測定RNA濃度及純度（A260/A280）。用第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉錄，反應體系總體積20 μl，37℃反轉錄15 min，85℃5 s，得到cDNA，-20℃冰箱保存。相對定量分析采用染料法。PCR反應體系為20 μl，包括上游和下游引物各 0.8 μl，cDNA 2 μl，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl，ROXDyeⅡ 0.4 μl，雙蒸水6 μl。標準程序兩步法PCR擴增：95℃ 30 s，1個循環；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環。組織蛋白酶B上游引物：5′-CTGACCGGATCTGCATCCAC-3′，下游引物：5′-GAAGTTCCAAGCTTCAGCAGGATAG-3′，擴增片段長度131 bp；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增片段長度138 bp。使用ABI PRISM 7500型實時熒光定量PCR儀反應，結束后讀取擴增曲線、熔解曲線和Ct值，用2-ΔΔCt法計算目的基因和內參基因的相對表達水平。重復3次實驗，結果取均值。

三、統計學處理

數據采用SPSS13.0統計軟件行分析。結果行方差齊性檢驗，多組間比較采用方差分析（ANOVA），兩組間比較采用最小顯著差異（LSD）法。實驗數據以±s表示，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、不同劑量UVA照射后細胞增殖活性

UVA照射后24、48和72 h，0～25 J/cm2UVA呈劑量依賴性抑制HDF增殖。見表1。UVA劑量≤10 J/cm2照射后24、48、72 h，細胞存活率均保持在85%以上；而UVA劑量≥15 J/cm2時細胞存活率明顯下降，≥ 20 J/cm2時為50%左右，至25 J/cm2時僅約25%，與對照組相比差異均有統計學意義（均P＜0.01）。故后續實驗選擇10 J/cm2UVA照射HDF造成的急性光損傷。

表1 長波紫外線（UVA）照射后24、48、72 h人皮膚成纖維細胞的增殖活性（A450，±s）

表1 長波紫外線（UVA）照射后24、48、72 h人皮膚成纖維細胞的增殖活性（A450，±s）

注：n=3

組別 24 h 48 h 72 h對照組 1.00 1.00 1.00 5 J/cm2UVA照射組 0.98±0.01 0.97±0.02 0.97±0.02 10 J/cm2UVA照射組 0.92±0.02 0.91±0.01 0.91±0.01 15 J/cm2UVA照射組 0.82±0.02 0.76±0.01 0.76±0.02 20 J/cm2UVA照射組 0.64±0.05 0.58±0.03 0.58±0.03 25 J/cm2UVA照射組 0.31±0.03 0.20±0.01 0.20±0.02 F值 267.00 949.00 500.00 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

二、UVA照射后不同時間CatB mRNA及蛋白表達

10 J/cm2UVA 照射 HDF 后 24、48、72 h，CatB mRNA的表達照射組較相應對照組均升高，其中72 h升高最為明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。CatB蛋白表達均較相應對照組上調，并在48 h達峰值，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

三、不同劑量UVA照射HDF后48 h CatB mRNA及蛋白表達

圖1 10 J/cm2UVA照射人皮膚成纖維細胞后不同時間組織蛋白酶B（CatB） 蛋白的表達 1、3、5：分別為對照組24 h、48 h、72 h時； 2、4、6：分別為照射組 24、48、72 h 時。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖2 長波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細胞后48 h組織蛋白酶 B（CatB）蛋白的表達 1： 對照組； 2 ～ 5：10、15、20、25 J/cm2 UVA照射組。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表3 長波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細胞后48 h組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達（±s）

表3 長波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細胞后48 h組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達（±s）

注：n=3

組別 CatB mRNA CatB蛋白對照組 1.00±0.00 0.60±0.05 10 J/cm2UVA照射組 1.16±0.05 0.99±0.07 15 J/cm2UVA照射組 1.27±0.06 1.49±0.14 20 J/cm2UVA照射組 1.46±0.04 1.89±0.08 25 J/cm2UVA照射組 1.70±0.02 2.07±0.06 F值 95.15 149.29 P值 ＜0.05 ＜0.05

表2 10 J/cm2長波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細胞后不同時間組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達（±s）

表2 10 J/cm2長波紫外線（UVA）照射人皮膚成纖維細胞后不同時間組織蛋白酶B（CatB）mRNA及蛋白表達（±s）

注：n=3

組別 mRNA蛋白24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h對照組 0.089±0.015 0.091±0.010 0.111±0.017 0.35±0.01 0.45±0.12 0.61±0.06 UVA組 0.149±0.009 0.173±0.009 0.185±0.158 0.76±0.14 1.34±0.38 0.82±0.09 t值 5.63 10.9 5.57 3.99 3.89 3.36 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

10、15、20、25 J/cm2UVA 照射 HDF 后 48 h，CatB mRNA表達呈劑量依賴性上升，各UVA照射組與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。CatB蛋白表達較對照組升高，并呈劑量依賴性升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖2。

討 論

CatB屬于半胱氨酸組織蛋白酶，作用底物廣泛，可降解Ⅳ型膠原、纖維蛋白原、纖連蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖等多種基質成分［4］。近年組織蛋白酶在光損傷中的作用也受到關注［5-6］。

Lai等［7］研究發現，CatB在正常皮膚組織有表達，在誘導光老化的皮膚組織及成纖維細胞中表達下降，推測CatB表達減少可能通過減弱皮膚修復功能、導致細胞外基質平衡失調參與光老化發生。Lamore等［8］對UVA照射慢性光損傷后成纖維細胞進行蛋白質組學分析，發現下調最明顯的也是CatB。還發現慢性UVA照射可導致CatB成熟過程改變并特異性使酶喪失活性，但該研究未見CatB基因表達的數據。Bivik等［9］用60 J/cm2UVA和500 mJ/cm2UVB誘導人黑素細胞急性光損傷，在黑素細胞凋亡過程中觀察到CatB定位發生改變，從溶酶體轉移至胞質，但是對于CatB的表達變化未見研究報道。本研究結果顯示，UVA單次照射HDF致急性光損傷后，CatB蛋白和mRNA表達在照射后24、48、72 h均增加，并且CatB蛋白升高以48 h最明顯；同時用不同劑量UVA照射后發現，CatB蛋白和mRNA的表達隨UVA劑量增加表達上調也增加。

UVA照射后慢性光損傷和急性光損傷細胞模型中CatB表達改變呈相反趨勢。這種急、慢性光損傷中的不同變化趨勢，可能預示CatB在兩種光損傷過程中的作用存在不同。在老化細胞中脂褐素堆積是重要的表現［10-11］，所謂脂褐素是指細胞內形成和積聚的高度氧化和交聯的蛋白質，絕大多數的脂褐素局限于溶酶體內，老化的細胞較年輕的細胞含有更多的脂褐素。從降解受損的自身蛋白的作用考慮，光老化成纖維細胞中下降的CatB可能使溶酶體清除受損的細胞蛋白的能力下降，從而造成細胞內脂褐素堆積，光老化發生。而在急性光損傷中，UVA可能通過提高轉錄、增加CatB釋放等途徑提高CatB表達水平，上調的CatB則通過其具有的膠原降解、蛋白水解能力參與光損傷的發生。CatB還可清除金屬蛋白酶組織抑制劑-1、2［12］，當 CatB 表達上調時，其清除作用也增強，進而導致MMP激活，加劇光損傷。還有研究表明，CatB可導致尿激酶纖溶酶原激活物和組織型纖溶酶原激活物釋放，激活纖溶酶，促發蛋白水解級聯反應［13］，從而進一步促發光損傷。

有研究［14］顯示，在慢性光損傷的皮膚成纖維細胞中CatB酶的活性受到明顯抑制。CatB功能的多樣性使得其在光損傷中可能起到多重作用，在急、慢性光損傷中發揮不同的功效。

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2013-12-13）

（本文編輯：尚淑賢）

Expression of cathepsin B in acute ly photodamaged fibroblasts and its significance

Hou Wei*,Xu Qingfang,Liu Chen,Zheng Yue,Lai Wei.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

；Lai Wei,Email；drlaiwei@163.com

ObjectiveTo investigate the changes in cathepsin B （CatB） expression in acutely photodamaged human dermal fibroblasts （HDFs） and their significance.MethodsHDFs were isolated from the foreskin of children,and subjected to primary culture and subculture.The fourth-to eighth-passage HDFs were used in the following experiment.HDFs were divided into two groups to receive irradiation with different doses of ultraviolet A（UVA） for different durations（acutely photodamaged group） or remain unirradiated（control group）.Cell counting kit-8 （CCK8）assay was conducted to evaluate the proliferative activity of HDFs after irradiation with UVA at 5,10,15,20 and 25 J/cm2respectively.Western blot and quantitative real-time reverse transcription PCR were performed to measure the protein and mRNA expressions of CatB respectively in HDFs at 24,48 and 72 hours after exposure to UVA at 10 J/cm2,and at 48 hours after exposure to UVA at 10,15,20 and 25 J/cm2.Statistical analysis was carried out by analysis of variance and least significant difference（LSD）test using the SPSS 13.0 software.ResultsUVA radiation induced a decrease in the proliferative activity of HDFs.When the dose of UVA was≤10 J/cm2,the survival rate of HDFs maintained higher than 85%,and significant differences were observed in cell survival rate between unirradiated and irradiated HDFs at 24,48 and 72 hours （allP＜ 0.05）.Western blot showed that the gray value of CatB protein in the acutely photodamaged group irradiated with 10 J/cm2UVA was significantly higher than that in the control group at 24 hours（0.76±0.14 vs.0.35±0.01,P＜0.05）,48 hours（1.34±0.38 vs.0.45±0.12,P＜0.05）and 72 hours（0.82±0.09 vs.0.61±0.06,P＜0.05）.Increased mRNA expressions of CatB were also observed in the acutely photodamaged group compared with the control group at 24 hours（0.149±0.009 vs.0.089±0.015,P＜0.05）,48 hous（0.173±0.009 vs.0.091±0.010,P＜0.05）and 72 hours（0.185 ± 0.158 vs.0.111 ± 0.017,P＜ 0.05）after UVA radiation at 10 J/cm2.The gray value of CatB protein was 0.99±0.07,1.49±0.14,1.89±0.08,2.07±0.06 in HDFs at 48 hours after exposure to UVA of 10,15,20 and 25 J/cm2,respectively,significantly higher than that in the control group（0.60 ± 0.05,allP ＜ 0.05）.Similarly,the mRNA expression of CatB was up-regulated in HDFs at 48 hours after UVA radiation at 10,15,20 and 25 J/cm2compared with the unirradiated HDFs.ConclusionThe protein and mRNA expressions of CatB are up-regulated in acutely photodamaged HDFs induced by UVA radiation.

Fibroblasts；Ultraviolet rays；Radiation injuries,experimental；Cathepsin B

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.003

國家自然科學基金（81171523）；廣東省自然科學基金（10151008901000117）

830054烏魯木齊，新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科（侯巍）；中山大學附屬第三醫院皮膚性病科（許慶芳、劉晨、鄭躍、賴維）

賴維，Email：drlaiwei@163.com