白癜風自體培養黑素細胞移植療效與白細胞介素17、Foxp3的相關性研究

李曉文 林福全 張迪敏 洪為松 許愛娥

白癜風自體培養黑素細胞移植療效與白細胞介素17、Foxp3的相關性研究

李曉文 林福全 張迪敏 洪為松 許愛娥

目的探討白癜風自體培養黑素細胞移植療效與白細胞介素17、Foxp3的相關性。方法對40例穩定期尋常型白癜風患者進行自體培養黑素細胞移植,同時收集其外周血,6個月后根據移植效果將收集的血液分為成功組25例,失敗組15例。用ELISA的方法測定移植成功與移植失敗外周血中白細胞介素17及Foxp3水平,比較移植成功組與失敗組血清中白細胞介素17及Foxp3水平的差異。用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。結果移植成功組血清中白細胞介素17(15.29±7.86)ng/L,明顯低于移植失敗組(43.88± 13.02)ng/L,差異有統計學意義。血清中Foxp3的水平,移植成功組(6.08±2.03)ng/L,高于移植失敗組(3.37± 1.81)ng/L,兩者之間比較,差異有統計學意義。結論血清白細胞介素17水平升高、Foxp3水平降低與白癜風患者的移植失敗有相關性。

白癜風;白細胞介素17;Foxp3;細胞移植;移植,自體;治療結果

白癜風是一種與自身免疫相關的色素脫失性疾病,其發病機制尚未明確,白癜風患者血清和組織內發現有大量細胞因子異常分泌[1-3],如:白細胞介素(IL)10、IL-13、IL-17A等。自體培養黑素細胞移植是近幾年來治療穩定期白癜風的一種有效的方法,我院[4]采用自體培養的黑素細胞移植治療了632例患者(最大面積達640 cm2),總有效率為82.28%,痊愈率為52.85%,但仍有部分患者移植效果不佳,可能與細胞因子介導的免疫異常有關[5]。我們從細胞因子IL-17與Foxp3水平研究其與移植療效的相關性。

一、資料與方法

1.臨床資料:40例尋常型穩定期白癜風患者均來自本院皮膚科門診。其中男18例,女22例,年齡10～68歲,平均29歲,病程1～30年,平均7.9年,所有患者的診斷與分型均符合文獻[6],且均為尋常型,穩定時間≥6個月。移植部位位于面頸部21例、軀干部11例、四肢部8例,移植后6個月觀察療效,我們將復色面積≥70%定義為移植成功組,將復色面積≤20%定義為移植失敗組,所有患者均非節段型白癜風,無甲狀腺等其他自身免疫性疾病及嚴重系統性疾病。本研究通過本院倫理委員會批準,移植治療的患者均簽署知情同意書。

2.標本采集:患者移植當日于晨8時空腹采集外周靜脈血5 ml,靜置1 h后以1 157×g離心,20 min后取上清液裝于微量離心管中,封口儲存在-80℃冰箱內備檢。6個月后,根據隨訪情況將其納入移植成功組或移植失敗組。

3.自體培養的黑素細胞移植:將虹膜剪剪下的供皮區正常皮膚置于無菌D-Hanks液中,用0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA先后在37℃消化10 min。在立體顯微鏡下刮下角質層下及真皮上的細胞。用D-Hanks液沖洗后以半徑5 cm, 129×g,離心5 min,收集沉淀細胞重懸浮于黑素細胞Hul6選擇性培養基(F12基礎培養基,含bFGF、CT、IBMX和胎牛血清)中,并將細胞團吹打成細胞懸液,調整細胞濃度5× 105/ml接種于培養瓶中,置37℃、5%CO2培養箱內培養。在第3天加入基因素(100 μg/m1)以去除角質形成細胞和成纖維細胞的污染,隔天換液1次。當黑素細胞融合后,用0.05%胰酶-EDTA將黑素細胞從培養瓶上消化下來進行傳代培養。當細胞數量達到最優接種量[4]時,將黑素細胞從培養瓶上消化下來,離心收集黑素細胞懸浮于F12培養基中備用。用CO2激光磨削掉利多卡因局部麻醉后的受皮區,根據移植白斑區的面積,按600～1 000個細胞/mm2[7]收集黑素細胞,用巴氏吸管將細胞懸液均勻地接種在移植區。無菌凡士林紗布覆蓋,外敷含F12培養液濕紗布,包扎固定。囑咐患者平臥休息1 h,7～10 d后去除紗布,6個月后觀察移植療效。

4.檢測方法:人IL-17試劑盒購自美國RD公司,Foxp3 (Human forhead box P3)試劑盒購自美國Mybiosource公司,用ELISA法檢測。操作步驟按照試劑盒說明書進行。根據標準曲線和直線回歸方程式,計算IL-17、Foxp3濃度。

5.統計分析:使用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。計量資料用±s表示,兩組間樣本均數比較用獨立樣本t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.臨床資料比較:移植成功組25例,其中男10例,女15例,平均年齡(28.92±11.25)歲,病程(7.8±7.11)年,白斑穩定時間(14.76±12.04)個月,移植面積(42.08±34.83)cm2,平均復色率為88%;移植失敗組15例,其中男8例,女7例,平均年齡(30.33±13.81)歲,病程(8.06±5.92)年,白斑穩定時間(13.33±4.60)個月,平均移植面積(37.66±20.77),移植成功組與失敗組在性別、年齡、病程、穩定時間及移植面積方面相匹配,具有可比性。

2.白癜風患者外周血中IL-7、Foxp3的檢測:移植成功組血清中IL-17(15.29±7.86)ng/L、失敗組(43.88±13.02)ng/L,移植成功組明顯低于移植失敗組,兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。血清中Foxp3的水平,成功組(6.08±2.03)ng/L,失敗組(3.37±1.81)ng/L,移植成功組明顯高于移植失敗組(P＜0.05),兩者之間差異有統計學意義。見表1。

表1 白癜風移植成功組與移植失敗組外周血IL-17、Foxp3的檢測(±s) ng/L

表1 白癜風移植成功組與移植失敗組外周血IL-17、Foxp3的檢測(±s) ng/L

注:兩組比較,P＜0.01

組別 例數 IL-17 Foxp3成功組 25 15.29±7.86 6.08±2.03失敗組 15 43.88±13.02 3.37±1.81 t值 7.70 4.32 P值 0.01 0.01

三、討論

自體黑素細胞移植是一種治療白癜風的有效方法,適用于傳統方法治療無效的穩定期白癜風。雖然使用個體化培養基進行自體黑素細胞培養使移植效果明顯提高[8],但仍有部分患者移植失敗或效果不佳,可能與尋常型穩定期白癜風患者局部白斑皮膚處于免疫異常狀態[9]相關。我們的實驗發現,在移植成功與移植失敗的白癜風外周血中,移植成功組血清中的IL-17水平明顯低于移植失敗組,且差異有統計學意義(P＜0.05)。IL-17被認為是Th-17細胞產生的最主要的細胞因子,有促炎癥和機體防御功能[10]。有研究表明,IL-17在白癜風患者皮損處組織液中的表達水平升高[9-10]。Bassiouny等[2]報道,白癜風患者血清及組織中的IL-17水平均較正常對照組高,說明黑素細胞處于破壞階段。與此同時,我們還發現在移植成功與移植失敗的白癜風外周血中,Foxp3+的水平顯著高于移植失敗組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

我們的研究表明,移植失敗組血清中的IL-17表達增高,而Foxp3水平下降,我們推測移植失敗的原因可能是:一方面Th17介導的炎癥反應亢進,過度及持續表達的IL-17可能通過刺激炎癥細胞產生IFN-r,IL-6,IL-8等炎癥因子而對黑素細胞產生損傷,從而導致移植部位黑素細胞的凋亡。另一方面是Treg細胞免疫抑制功能的降低,Foxp3+水平的降低使Treg細胞的免疫抑制功能降低,不能抑制自身反應性T細胞的活化,導致自身炎癥反應的持續存在,從而使黑素細胞受損,導致移植效果不佳。導致IL-17及Foxp3失衡的誘因尚不清楚。由于我們的樣本量較小,還需要更多的研究。

[1]Tembhre MK，Sharma VK，Sharma A，et al.T helper and regulatory T cell cytokine profile in active，stable and narrow band ultraviolet B treated generalized vitiligo[J].Clin Chim Acta，2013，424:27-32.

[2]Bassiouny DA，Shaker O.Role of interleukin-17 in the pathogenesis of vitiligo[J].Clin Exp Dermatol，2011，36(3):292-297.

[3]李廷慧，侯曉彬，肖漓，等.CD4+CD25+調節性T細胞與Foxp3表達在白癜風發病中的作用[J].中國美容醫學，2009，6(18): 819-822.

[4]洪為松，傅麗芳，尉曉東，等.自體黑素細胞移植治療白癜風細胞接種量與療效關系研究[J].中華皮膚科雜志，2013，46(4): 235-238.

[5]Wu J，Zhou M，Wan Y，et al.CD8+T cells from vitiligo perilesional margins induce autologous melanocyte apoptosis[J].Mol Med Rep，2013，7(1):237-241.

[6]中西醫結合學會皮膚病專業委員會色素病學組.白癜風臨床診斷分型與療效標準(2003年修訂稿)[J].中華皮膚科雜志，2004，37(7):440.

[7]Hong WS，Hu DN，Qian GP，et al.Treatment of vitiligo in children and adolescents by autologous cultured pure melanocytes transplantation with comparison of efficacy to results in adults [J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2011，25(5):538-543.

[8]張迪敏，洪為松，傅麗芳，等.個體化培養自體黑素細胞移植治療白癜風[J].中華皮膚科學雜志，2010，43(10):721-725.

[9]宋秀祖，許愛娥，宋秀芬.白癜風患者調節性T細胞及單核細胞趨化蛋白-1及可溶性細胞間黏附分子-1的檢測[J].中華皮膚科雜志，2006，39(2):95-97.

[10]Shen F，Gaffen SL.Structure-function relationships in the IL-17 receptor:implications for signal transduction and therapy[J]. Cytokine，2008，41(2):92-104.

2013-12-04)

(本文編輯:吳曉初)

Relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation and serum levels of interleukin-17 and FoxP3 in patients with vitiligo

Li Xiaowen，Lin Fuquan，Zhang Dimin，Hong Weisong，Xu Ai′e.Department of Dermatology，Third People′s Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Xu Ai′e，Email:xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo investigate the relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation and serum levels of interleukin-17(IL-17)and FoxP3 in patients with vitiligo.MethodsForty patients with stable vitiligo vulgaris were included in this study，and

autologous cultured melanocyte transplantation.Six months after the transplantation，treatment efficacy was evaluated，and patients were classified into the successfully treated group(n=25)and unsuccessfully treated group(n=15).Peripheral blood was collected from all the patients before the transplantation，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to measure the serum levels of IL-17 and FoxP3.Statistical analysis was done using two independent samplest-test with the SPSS software(version 17.0).ResultsThe successfully treated patients showed lower serum levels of IL-17((15.29±7.86)vs.(43.88±13.02)ng/L，P＜0.05)，but higher serum levels of FoxP3 ((6.08±2.03)vs.(3.37±1.81)ng/L，P＜0.05)than the unsuccessfully treated patients.ConclusionThe increased serum IL-17 and decreased serum FoxP3 may contribute to the failure of autologous cultured melanocyte transplantation in patients with vitiligo.

Vitiligo;Interleukin-17;Forhead box P3;Cell transplantation;Transplantation，autologous; Treatment outcome

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.016

國家自然科學基金(81071294、81271758);浙江省自然科學基金(z2100973);省部共建項目(WKJ2012-2-036);杭州市重大科技創新項目(20122513A02)

310009杭州市第三人民醫院皮膚科

許愛娥,Email:xuaiehz@msn.com