阿魏酸對黑素細胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表達的影響

吳艷華 湯楠 蔡蘭花 李其林

阿魏酸對黑素細胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表達的影響

吳艷華 湯楠 蔡蘭花 李其林

目的探討阿魏酸對體外培養的正常人表皮黑素細胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表達的影響。方法以不同濃度的阿魏酸干預體外培養的正常人表皮黑素細胞,用MTS法分別檢測培養24、48、72 h后黑素細胞的增殖活性。用NaOH裂解法檢測培養72 h后黑素細胞的黑素合成。用多巴氧化反應法測定培養72 h后黑素細胞酪氨酸酶活性。用Western印跡法測定培養72 h黑素細胞c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達水平。結果與對照組相比,0.01、0.1、1 mg/ml阿魏酸在作用24、48、72 h后,抑制黑素細胞增殖作用的差異有統計學意義(均P＜0.05),其中1 mg/ml阿魏酸作用72 h抑制黑素細胞活性最高。0.01、0.1、1 mg/ml阿魏酸均能顯著影響黑素合成和酪氨酸酶活性,并可降低黑素細胞中c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達水平,與對照組相比,差異有統計學意義(均P＜0.05)。結論阿魏酸可抑制培養的人表皮黑素細胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性,并可下調黑素細胞c-kit蛋白及ERK蛋白的表達。

阿魏酸;黑素細胞;細胞增殖;酪氨酸;原癌基因蛋白質c-kit

黃褐斑主要病因可能與紫外線、內分泌、遺傳、氧自由基、藥物與化妝品、口服避孕藥、局部微生態、機體系統性病變、情緒波動等因素有關[1]。其發病機制有多種學說:①黃褐斑患者皮損區黑素細胞的合成功能活躍,基底層黑素顆粒增加,但黑素細胞卻沒有增殖[2];②黃褐斑皮損區表皮不僅黑素細胞數目增多,同時伴有基底層黑素細胞和黑素顆粒增加[3]。阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸)是當歸、川芎、升麻等中藥的有效成分之一,國內學者在當歸對黃褐斑的治療方面進行了初步研究,得到了較為積極的結果[4]。已有研究表明,阿魏酸有抗氧化的作用,可用于皮膚病治療,如黃褐斑等[5]。但阿魏酸治療黃褐斑的具體作用機制尚未明確,我們旨在研究當歸單體阿魏酸對人表皮黑素細胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit蛋白、ERK蛋白表達的影響,探討阿魏酸治療黃褐斑的可能機制。

材料與方法

一、試劑與材料

黑素細胞株購于美國Lonza公司,為正常成人表皮黑素細胞,貨號CC-2586(NHEM-Ad),生產批號21793-0127。阿魏酸購于中國食品藥品檢定研究所,以MBM完全培養基配制成100 mg/ml的溶液,置于-20℃的冰箱中保存。臨用前以新鮮MBM完全培養基調配至實驗所需濃度,根據預實驗結果,設定阿魏酸實驗終濃度為0.01、0.1、1 mg/ml。

主要試劑:黑素細胞基礎培養基MBMTM-4(貨號CC-3250)、黑素細胞生長添加劑MGMTM-4(貨號CC-4435)、類皮素-3 Endothelin-3(貨號CC-4510)、左旋多巴(L-Dopa)、Trypain/EDTA Solution(美國Lonza公司)。MTS、4%甲醛(武漢博士德生物工程有限公司),中性樹膠(上海恒遠生物科技有限公司), SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術研究所),蛋白Marker(美國Thermo公司),Tris(廣州生物科技有限公司),羊抗兔IgG(美國Earthoc公司)。c-kit Rabbit mAb、ERK1/2 Rabbit mAb(美國Cell Signaling公司)。

二、方法

1.黑素細胞的培養及鑒定:完全黑素細胞培養基:MBMTM-4、MGMTM-4、Endothelin-3混勻液,置入100 ml的分裝瓶中,放入-4℃的冰箱中保存。正常成人表皮黑素細胞株接種于細胞培養瓶中,生長融合達70%～80%時可進行傳代培養,1∶2傳代,每瓶加入約3～4 ml的完全培養基,移入37℃含CO2濃度為5%的恒溫培養箱中培養。

L-Dopa染色法鑒定黑素細胞,取處于對數生長期的正常人表皮黑素細胞,調整細胞濃度為2.5× 104/ml,接種于已添加相應蓋玻片的6孔細胞培養板中培養,4%甲醛固定細胞20～25 min,L-Dopa染色液40 min,每隔30 min觀察黑素細胞的染色情況,更換染液,約3 h后染液呈棕色,終止染色漂洗蓋玻片2 min,蘇木素復染細胞核,梯度酒精逐級脫水,中性樹膠封片,常溫下晾干,激光共聚焦顯微鏡下觀察黑素細胞的鑒定情況,拍照。

2.MTS法測定黑素細胞增殖:以5×104/ml接種于96孔細胞培養板中,培養24 h,分別加入不同濃度阿魏酸,設對照組(僅黑素細胞和完全培養基)。每個濃度設5個復孔,分別培養24、48、72 h,觀察黑素細胞形態變化,加入MTS顯色液,每孔20 μl,37℃培養4 h終止培養,490 nm波長下檢測各孔吸光度A值。

3.NaOH裂解法測定黑素細胞的黑素合成:預先用不同濃度阿魏酸溶液培養細胞72 h。每孔加入100 μl濃度為1 mmol/L的NaOH溶液裂解細胞, 37℃水浴箱中水浴1 h,酶標儀在450 nm波長下測量各孔吸光度A值。

4.Dopa氧化反應法測定黑素細胞酪氨酸酶活性:預先用不同濃度阿魏酸溶液培養細胞72 h。每孔加入90 μl濃度為1%的TritonX-100溶液,置入-80℃冰箱中凍存30 min,室溫使細胞完全裂解,每孔加入10 μl濃度為0.1%的L-Dopa溶液,恒溫37℃,含CO2濃度為5%培養箱中孵育2 h,酶標儀在490 nm波長下測量各孔吸光度A值。

5.Western印跡法測定黑素細胞c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達水平:預先用不同濃度阿魏酸溶液培養細胞72 h。根據RIPA裂解液(強)試劑盒說明書提取黑素細胞蛋白,-80℃低溫冰箱中保存;配好分離膠及濃縮膠,加入蛋白樣品。電泳:濃縮膠用80 V時間30～40 min、分離膠100 V時間60～70 min,終止電泳后轉膜;封閉及雜交:結合一抗、二抗。化學發光及凝膠圖象分析:采用Super ECL發光液,采用凝膠圖象處理分析系統(Image Lab)進行條帶分析,分析每條條帶的灰度值,同時計算每組目的條帶蛋白灰度值與內參條帶蛋白灰度比值。

6.統計學方法:用統計學軟件SPSS17.0進行統計學分析,計量資料用±s表示,兩個因素的組間比較采用兩個因素多個水平的析因設計與方差分析,單個因素的組間比較采用單因素方差分析(one way-ANOVA),方差齊時采用 SNK(Student-Newman-Keuls)法進行組間兩兩比較;各組方差不齊,則采用Tamhane T2檢驗方法,P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、正常人表皮黑素細胞的培養及鑒定

正常人表皮黑素細胞傳代培養經12～24 h后即可貼壁,倒置顯微鏡下可見呈梭形的樹突狀細胞,樹突形狀細長。細胞傳代培養24 h后首次換液。后期每隔2～3天換一次液,倒置顯微鏡下可見黑素細胞逐漸增殖,樹突數量逐漸增多至2個以上,最多者可達6～7個樹突。約10～15 d后,黑素細胞接近融合狀態(70%～80%),細胞樹突間交織成網狀,則可進行傳代,可見大量的黑素細胞(圖1)。經左旋多巴(L-Dopa)染色后的正常人表皮黑素細胞,呈陽性反應,黑素細胞各細胞樹突及胞質呈黑色或棕褐色(圖2)。

圖1 培養的正常黑素細胞(×200)

圖2 左旋多巴染色鑒定的黑素細胞(×200)

二、阿魏酸對黑素細胞增殖活性的影響

與對照組相比,0.01、

0.1、1 mg/ml阿魏酸在作用24、48、72 h后,抑制黑素細胞增殖作用的差異有統計學意義(均P＜0.05),其中1 mg/ml阿魏酸作用72 h抑制黑素細胞增殖活性最高。見表1。

表1 阿魏酸對黑素細胞增殖的影響(A值,±s)

表1 阿魏酸對黑素細胞增殖的影響(A值,±s)

注:與對照組比較,a:P＜0.05

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三、阿魏酸對黑素細胞黑素合成的影響

各組數據經方差分析結果顯示:不同濃度阿魏酸溶液對黑素細胞黑素合成的影響不同(F= 36.924,P=0.000),差異有統計學意義;即隨著阿魏酸濃度的增大黑素合成逐漸減少,0.01 mg/ml組、0.1 mg/ml組、1 mg/ml組較對照組,對黑素合成均有統計學意義,1 mg/ml組較0.01 mg/ml組對黑素合成抑制較明顯,差異有統計學意義,但0.1 mg/ml組與0.01 mg/ml組、1 mg/ml組比較,對黑素合成的影響差異無統計學意義。見表2。

表2 阿魏酸對黑素合成的影響(±s)

表2 阿魏酸對黑素合成的影響(±s)

注:與對照組相比,a:P＜0.05;與0.01 mg/ml組相比,b:P＜0.05

組別 復孔對照組 5 0.01 mg/ml組 5 0.1 mg/ml組 5 1 mg/ml組 5 A值0.039±0.006 0.028±0.002a 0.025±0.001a 0.021±0.001ab

四、阿魏酸對酪氨酸酶活性的影響

各組數據經方差分析結果顯示:不同濃度阿魏酸溶液對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響不同(F= 333.017,P=0.000),方差分析差異有統計學意義,即隨著阿魏酸濃度的增大酪氨酸酶活性逐漸減弱, 0.01 mg/ml組、0.1 mg/ml組、1 mg/ml組較對照組,對酪氨酸酶活性影響差異均有統計學意義,1 mg/ml組較0.01 mg/ml組、0.1 mg/ml組對酪氨酸酶活性,差異均有統計學意義。見表3。

表3 阿魏酸對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響(±s)

表3 阿魏酸對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響(±s)

注:與對照組相比,a:P＜0.05;與0.01 mg/ml組相比,b:P＜0.05;與0.1 mg/ml組相比,c:P＜0.05

A值0.162±0.006 0.144±0.003a 0.121±0.002ab 0.095±0.005abc組別 復孔對照組 5 0.01 mg/ml組 5 0.1 mg/ml組 5 1 mg/ml組 5

五、阿魏酸對黑素細胞c-kit及ERK1/2蛋白表達水平的影響

與對照組比較,0.01、0.1、1 mg/ml c-kit蛋白表達及ERK1/2均有明顯降低(P＜0.05);以1 mg/ml組下降最顯著。見表4,圖3,4。

表4 阿魏酸對黑素細胞c-kit及ERK1/2蛋白表達水平的影響(±s)

表4 阿魏酸對黑素細胞c-kit及ERK1/2蛋白表達水平的影響(±s)

注:與對照組比較,a:P＜0.05;與0.01mg/ml組比較,b:P＜0.05;與0.1 mg/ml組相比,c:P＜0.05

c-kit ERK1/2 0.46±0.06 1.89±0.12 0.37±0.03a 0.85±0.07a 0.34±0.02ab 0.76±0.08ab 0.18±0.03ab 0.63±0.18abc組別 復孔對照組 5 0.01mg/ml組 5 0.1mg/ml組 5 1mg/ml組 5

圖3 阿魏酸對黑素細胞c-kit蛋白表達水平的影響

圖4 阿魏酸對黑素細胞ERK1/2蛋白表達水平的影響

討論

阿魏酸主要有抗氧化[5]、清除氧自由基、有效抑制血小板聚集和血栓形成等方面的藥理活性[6]。Di Domenico等[7]研究表明,阿魏酸的抗氧化作用可保護色素增多性皮膚病引起的氧化應激反應,同時對活性氧的產生、蛋白質氧化和脂質過氧化也有保護作用。張延萍等[8]認為,阿魏酸不僅能降低酪氨酸酶的單酚酶活力,還能明顯地延長酪氨酸酶反應的遲滯時間,是一種強效的酪氨酸酶抑制劑。本實驗結果表明:與對照組比較,不同濃度組的阿魏酸溶液對黑素細胞增殖、黑素細胞黑素合成、酪氨酸酶活性均有明顯的抑制作用(P＜0.05),結果提示,阿魏酸可抑制酪氨酸酶活性,抑制黑素合成,這可能是阿魏酸治療黃褐斑有效機制之一。

黑素細胞表面具有c-kit受體,c-kit受體即為酪氨酸酶受體。Alexeev等[9]認為,c-kit受體在黑素細胞生理學中起關鍵作用,主要影響黑素生成、增殖、遷移和存活的色素生成細胞。Luo等[10]通過對野生型小鼠和白斑突變型小鼠的配體和受體分子進行研究發現,c-kit受體主要是通過酪氨酸激酶信號通路的改變與皮膚、毛囊的色素障礙性疾病有關,表明了c-kit對黑素細胞的功能起作用。Moss等[11]研究顯示:小鼠和人類的毛發的色素脫失與c-kit的表達密切相關,越是色素缺失的皮損處,c-kit受體的表達越是減少。由此可見,c-kit受體的酪氨酸激酶信號通路在黑素細胞的黑素合成和黑素細胞的存活、遷移中起著重要作用,c-kit表達的減少導致黑素細胞的損傷。Goodall等[12]認為,可能通過抑制PDGF2β和IL21β等基因表達,抑制ERKl/2活性,后者可能進一步影響原癌基因的表達,而原癌基因表達的減少將直接導致與細胞增殖有關的蛋白質基因的轉錄和表達減少,從而抑制細胞增殖;同時通過激活MEK/ERK的信號通路導致磷酸化MITF在絲氨酸73表達,MITF是眾所周知的通過控制色素沉著的一種黑素生成調節酶,導致其降解。Yao等[13]研究認為:通過抑制黑素的合成能力,激活ERK途徑,從而抑制酪氨酸酶的活性,減少黑素合成。本研究結果顯示:不同濃度的阿魏酸溶液對黑素細胞的c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達水平均有下調作用。由此可見,抑制ERK1/2活性,則可抑制酪氨酸酶活性,使黑素合成減少,從而達到治療黃褐斑等色素增多性疾病的目地。

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2014-07-04)

(本文編輯:吳曉初)

Effect of ferulic acid on the proliferation of,as well as melanin synthesis,tyrosinase activity and expressions of c-kit and ERK proteins in keratinocytes

Wu Yanhua*，Tang Nan，Cai Lanhua，Li Qilin.*Fourth Affiliated Hospital of Jinan University School of Medicine;Department of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220，China

Wu Yanhua，Email:wuyanhua368@163.com

ObjectiveTo evaluate thein vitroeffect of ferulic acid on the proliferation of，as well as melanin synthesis，tyrosinase activity and expressions of c-kit and ERK proteins in cultured normal human epidermal melanocytes.MethodsCultured normal human epidermal melanocytes were treated with various concentrations of ferulic acid for different durations，and those remaining untreated served as the control.Then，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt(MTS)assay was performed to estimate cell proliferative activity at 24，48 and 72 hours，sodium hydroxide solubilization method to quantify melanin content in melanocytes at 72 hours，dopa oxidation assay to evaluate tyrosinase activity at 72 hours，Western blot to measure the expressions of c-kit and ERK1/2 proteins at 72 hours.ResultsCellular proliferative activity was significantly inhibited in melanocytes treated with ferulic acid of 0.01，0.1 and 1 mg/ml for 24，48 and 72 hours compared with untreated melanocytes(allP＜0.05)，and the 72-hour treatment with ferulic acid of 1 mg/ml showed the strongest inhibitory effect.Ferulic acid at 0.01，0.1 and 1 mg/ml all markedly suppressed melanin synthesis and tyrosinase activity，decreased the expressions of c-kit and ERK1/2 proteins in melanocytes，with significant differences in these parameters between ferulic acid-treated and untreated melanocytes(allP＜0.05).ConclusionsFerulic acid could downregulate the proliferation of，as well as melanin synthesis，tyrosinase activity，and expressions of c-kit and ERK proteins in cultured human epidermal melanocytes.

Ferulic acid;Melanocytes;Cell proliferation;Tyrosine;Proto-oncogene proteins c-kit

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.014

廣東省科技計劃項目(2011B031800034)

510220廣州,暨南大學醫學院第四附屬醫院、廣州市紅十字會醫院中醫科(吳艷華、湯楠、蔡蘭花),皮膚科(李其林)

吳艷華,Email:wuyanhua368@163.com