ITP患兒B細(xì)胞激活因子與血小板相關(guān)抗體的相關(guān)性分析

張軍紅，許華平，雷中勁（荊門市第一人民醫(yī)院兒科，湖北 荊門448000）

兒童出血性疾病中最常見的是免疫性血小板減少性紫癜（ITP），其發(fā)病率為0.25／萬(wàn)～0.50／萬(wàn)，常以自發(fā)性出血為首發(fā)表現(xiàn)，查血時(shí)見血小板減少，同時(shí)存在出血時(shí)間延長(zhǎng)及血塊收縮不良。其發(fā)病機(jī)理尚未完全明確，多認(rèn)為其經(jīng)典的發(fā)病機(jī)制是：患者自身存在免疫缺陷，在外來(lái)抗原的刺激下，機(jī)體產(chǎn)生血小板相關(guān)抗體（主要包括PAIgA、PAIgG及PAIgM）。血小板相關(guān)抗體不僅使已經(jīng)生成的血小板破壞增多，而且血小板相關(guān)抗體還引起骨髓中巨核細(xì)胞成熟障礙，導(dǎo)致血小板生成減少［1］。B細(xì)胞激活因子（BAFF）又稱BLyS，是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF家族新成員，在免疫機(jī)制中起著重要作用。它能與B淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合并誘導(dǎo)其增生、分化并分泌免疫球蛋白，在體液免疫中有著重要地位［2］。BAFF過量表達(dá)會(huì)破壞免疫耐受，故其在自身免疫性疾病如SLE的發(fā)病過程中扮演著重要角色。

本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)：與ITP治療后組及對(duì)照組相比較，治療前BAFF的表達(dá)明顯增高，推論在ITP患兒的發(fā)病機(jī)制中，增高的BAFF表達(dá)起著重要作用［3－4］。本研究進(jìn)一步檢測(cè)ITP患兒血小板相關(guān)抗體水平及BAFF的表達(dá)，探討B(tài)AFF在ITP發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

ITP患兒為實(shí)驗(yàn)組，共40例，2010年4月至2013年4月初次在本院兒科住院治療，女18例，男22例，年齡4歲7月～13歲8月，平均年齡4歲7月，所有患兒符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［5］。治療前血小板計(jì)數(shù)為（4～32）×109／L。確診后予腎上腺皮質(zhì)激素治療，其中28例加用丙種球蛋白（1g～2g／kg）沖擊治療。對(duì)照組共40例，都已排除血液系統(tǒng)疾病，為本院擇期行腹股溝疝及隱睪等手術(shù)的患兒。其中女20名，男20名，年齡5月～10歲8月，平均年齡2歲1月。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 40例ITP患兒入院第1～2天采血，治療后1個(gè)月采血（BPC＞100×109／L37例，50×109～100×109／L 3例）。對(duì)照組在手術(shù)前1天采血。常規(guī)抽取空腹靜脈血，離心收集血清，－80℃保存待測(cè)。同時(shí)采對(duì)照組及治療中及治療后組患兒靜脈血3ml，抗凝，按常規(guī)方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)離心后收集細(xì)胞沉淀。

1.2.2 檢測(cè) 血小板相關(guān)抗體（PAIgG及PAIgM）測(cè)定采用人血小板相關(guān)抗體（上海信然公司）ELISA試劑盒檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞BA FF－mRNA表達(dá)：引物設(shè)計(jì)合成和標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，根據(jù)GenBank的序列β－actin（AY582799）以及BAFF（AL157762），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由達(dá)安基因公司合成。總RNA制備以及cDNA鏈的合成，標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）檢測(cè)BAFF－mRNA表達(dá)水平按達(dá)安基因方法檢測(cè)［4］。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣本中BAFF－mRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血小板相關(guān)抗體水平

治療中組血小板相關(guān)抗體含量顯著高于治療后組血小板相關(guān)抗體含量（P＜0.01）；ITP患兒治療中組血小板相關(guān)抗體含量明顯高于對(duì)照組的血小板相關(guān)抗體含量（P＜0.01）；ITP患兒治療后組與對(duì)照組的血小板相關(guān)抗體含量相比較，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組PAIgG、PAIgM、BAFF－mRNA比較

2.2 各組PBMCs BAFF－mRNA 表達(dá)水平

PBMCs BAFF－mRNA表達(dá)水平在治療組中患兒明顯高于治療后組患兒和對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而治療后組患兒與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 關(guān)聯(lián)性分析

血小板相關(guān)抗體含量與外周血BAFF－mRNA表達(dá)水平顯著相關(guān)（r＝0.685，P＜0.05）。血小板相關(guān)抗體含量與血小板數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，治療前患兒血小板相關(guān)抗體含量較高，但其外周血中血小板數(shù)較低；相反，經(jīng)治療后血小板數(shù)升高時(shí)其血小板相關(guān)抗體含量較前降低。

3 討論

盡管ITP的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已證實(shí)血小板減少的確與PAIg相關(guān)。PAIg常為分三種亞型，PAIgG、PAIgM及PAIgA。研究證明：90%以上ITP患兒血小板表面存在PAIgG，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分患兒PAIgG和PAIgM同時(shí)存在增高表達(dá)，少數(shù)患兒PAIgA亦可增高［6］；亦有研究認(rèn)為PAIgM對(duì)觀察ITP的預(yù)后具有重要意義，初診時(shí)PAIgM或合并PAIgG異常增高的患兒對(duì)常規(guī)激素等免疫抑制治療的療效要差于PAIgM不增高的患兒［7］。本研究還發(fā)現(xiàn)，ITP患兒PAIg與血小板數(shù)呈負(fù)相關(guān)，這與以前報(bào)道一致。

BAFF在體液免疫上起著重要作用，BAFF表達(dá)不足則致免疫功能減低，表達(dá)過量可破壞免疫耐受導(dǎo)致自身免疫性疾病。已經(jīng)有大量的研究證實(shí)在SLE、干燥綜合征等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中，BAFF起著重要的作用。Szodoray等［8］研究了干燥綜合征患者B淋巴細(xì)胞的凋亡情況，同時(shí)進(jìn)一步研究了BAFF對(duì)相關(guān)B細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)干燥綜合征患者的bcl－2陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞凋亡降低。并據(jù)此推論明顯的抗凋亡作用可能通過BAFF和B淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)。本研究組前期試驗(yàn)證實(shí)ITP患兒BAFF水平有增高表達(dá)，經(jīng)治療病情好轉(zhuǎn)后下降，提示BAFF在ITP患兒的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［3－4］。本次研究進(jìn)一步證實(shí)ITP患兒存在BAFF－mRNA增高的表達(dá)，并與血小板相關(guān)抗體相關(guān)。支持在ITP患兒，血小板相關(guān)抗體血小板破壞仍是血小板減少的主要原因，它可能通過BAFF和B淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子降低B淋巴細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)血小板相關(guān)抗體的合成來(lái)決定起病以及病情的嚴(yán)重程度。

吳潤(rùn)暉等［9］認(rèn)為，急、慢性ITP患兒所處的免疫狀態(tài)可能不同：①免疫狀態(tài)好，在感染等因素刺激下，產(chǎn)生免疫監(jiān)視逃逸，隨病原菌清除而恢復(fù)，病程呈自限過程，此為急性ITP；②免疫失調(diào)和異常，即持久恒定的HLA－DR刺激性免疫應(yīng)答使體液免疫及細(xì)胞免疫出現(xiàn)紊亂，即使誘發(fā)因素消失，仍不能恢復(fù)，表現(xiàn)為慢性ITP。慢性、難治性ITP是治療的難點(diǎn)及重點(diǎn)，急慢性ITP發(fā)病機(jī)制是否存在差異，現(xiàn)正成為研究的熱點(diǎn)。隨著病例增多，將難治性ITP及慢性ITP分組作進(jìn)一步的研究，這正是我們下一步研究的目標(biāo)。

［1］ 秦平，候明 .特發(fā)性血小板減少性紫癜的發(fā)病機(jī)制 ［J］.國(guó)際輸血和血液學(xué)雜志，2007，30（6）：494－498.

［2］ 李曉琳 .BAFF信號(hào)的免疫調(diào)節(jié)作用 ［J］.國(guó)際免疫學(xué)雜志，2006，29（6）：368－370.

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［4］ 張軍紅，王從軍，雷中勁.B細(xì)胞激活因子在特發(fā)性血小板減少性紫癜中的表達(dá)與意義 ［J］.臨床血液學(xué)雜志，2014，27（3）：216－220.

［5］ 張之南，沈悌 .血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn) ［M］.3版 .北京：科學(xué)出版社，2007：116－121.

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［8］ Szodoray P，Jellestad S，Alex P，et al.Programmed cell death of peripheral blood B cells determined by laser scanning cytometry in Sjogren＇s syndrome with a special emphasis on BAFF ［J］.J Clin Immunol，2004，24：600－611.

［9］ 吳潤(rùn)暉 .兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜研究進(jìn)展 ［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22（3）：161－164.