HPLC法測(cè)定人血漿中拉莫三嗪的濃度及其影響因素研究

宋霞，張建隆，邱雯（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，蘭州730030；.天水市第一人民醫(yī)院藥劑科，甘肅天水 741000）

癲癇是腦部神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)慢性發(fā)作性疾病。藥物治療是治療癲癇的首選方法，對(duì)大約70%的癲癇患者治療有效。但傳統(tǒng)抗癲癇藥（如丙戊酸鈉、卡馬西平、苯巴比妥、苯妥英鈉、撲癇酮、乙琥胺）耐受性問(wèn)題嚴(yán)重，不良反應(yīng)較多，因而近十幾年來(lái)已有不少新型抗癲癇藥問(wèn)世。拉莫三嗪（Lamotrigine，LTG）是一種新型抗癲癇藥，是封閉電壓應(yīng)用依從性的鈉離子高通道阻滯藥，主要通過(guò)抑制神經(jīng)元釋放病理性谷氨酸遞質(zhì)而發(fā)揮抗癲癇（EP）作用，具有廣泛的抗癲癇譜，對(duì)多種類型的發(fā)作均有效。由于LTG適用人群廣、藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大，有必要對(duì)LTG用藥患者進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，以促進(jìn)LTG合理應(yīng)用及個(gè)體化用藥方案的調(diào)整。本文建立了HPLC法測(cè)定LTG血藥濃度，并收集我院癲癇患者LTG治療藥物監(jiān)測(cè)情況進(jìn)行相關(guān)分析。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC儀，包括G1315 A型二元泵、G1315 B型二極管陣列檢測(cè)器、G2170 AA型色譜工作站（美國(guó)安捷倫公司）；GENIUS電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；TGL-16 GB小型通用離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）。

1.2 藥品與試劑

拉莫三嗪對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100775-200401）；內(nèi)標(biāo)：氯霉素對(duì)照品（上海申藥股份有限公司，批號(hào)：941203）；卡馬西平對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100142-199503）；苯妥英鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100210-200401）；苯巴比妥（PB）對(duì)照品（國(guó)家麻醉品實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：1222-9602）；地西泮對(duì)照品（國(guó)家麻醉品實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：1230-9601）；氯硝西泮對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1227-9701）。對(duì)照品均為含量測(cè)定用。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 資料來(lái)源

2012年7月－2013年6月在我院癲癇中心、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科診治并進(jìn)行LTG治療藥物監(jiān)測(cè)的患者320例次，收集患者性別、年齡、體質(zhì)量、LTG維持劑量、末次服藥時(shí)間、取血時(shí)間、合并用藥的藥物和劑量等信息。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件：色譜柱為L(zhǎng)una C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/l磷酸二氫鉀，1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0，30∶70，V/V）；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為20 μl；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm。在該色譜條件下，拉莫三嗪與氯霉素的保留時(shí)間分別為7.48、11.73 min，色譜見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品高效液相色譜圖1.拉莫三嗪；2.氯霉素Fig 1 HPLC chromatograms of standard control1.lamotrigine；2.chloramphenicol

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取LTG對(duì)照品10.8 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1.08 mg/ml LTG儲(chǔ)備液。將LTG儲(chǔ)備液用甲醇稀釋，配制質(zhì)量濃度分別為4.0、8.0、16.0、40.0、64.0、80.0、96.0、128.0、160.0μg/ml的 LTG 標(biāo)準(zhǔn)溶液，將儲(chǔ)備液與標(biāo)準(zhǔn)溶液于4℃下保存。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取氯霉素對(duì)照品10.0mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得100 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，于4℃下保存。

2.1.4 血漿樣品的處理及測(cè)定：精密吸取血漿樣品200 μl，置1.5ml離心管中，加入甲醇25μl及內(nèi)標(biāo)溶液25μl，渦旋混勻30 s后加入300 μl甲醇沉淀，渦旋混勻1 min，以離心半徑為8 cm、10000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取濾液20 μl進(jìn)樣。

2.1.5 專屬性考察：取空白血漿200 μl，按“2.1.4”項(xiàng)下方法操作，取上清液20 μl進(jìn)樣分析，得到空白血漿色譜圖2 A。將空白血漿和拉莫三嗪與氯霉素對(duì)照品混合，按“2.1.4”項(xiàng)下方法操作，取上清液20 μl進(jìn)樣分析，得到樣品溶液色譜圖2 B。如圖2所示，在該色譜條件下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)拉莫三嗪的測(cè)定無(wú)影響。

2.1.6 線性關(guān)系考察：精密吸取空白血漿200μl共9份，置于1.5 ml離心管中，分別加入不同質(zhì)量濃度的LTG標(biāo)準(zhǔn)溶液25 μl及內(nèi)標(biāo)溶液25 μl，渦旋混勻30 s，使LTG血藥濃度分別相當(dāng)于0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0μg/ml。分別加入甲醇300 μl沉淀，渦旋混勻1 min，以離心半徑8 cm、10000 r/min離心10min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜濾過(guò)，取濾液20μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以LTG系列溶液的峰面積（As）和內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）之比（y）為縱坐標(biāo)、LTG質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝0.1736 x+0.0147（r＝0.9995，n＝9）。結(jié)果表明，LTG血藥濃度在0.5～20 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 回收率與精密度試驗(yàn)：分別于200μl空白血漿中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的LTG標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，渦旋混勻30 s，使血藥濃度分別相當(dāng)于1.0、10.0、20.0 μg/ml，按“2.1.4”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定。以LTG血藥濃度測(cè)得量與加入量之比計(jì)算方法回收率。以同日內(nèi)測(cè)得的LTG濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，以1周內(nèi)6次測(cè)定的LTG濃度計(jì)算日間精密度，詳見(jiàn)表1。

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of recovery and precision test（s±s ，n＝5）

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of recovery and precision test（s±s ，n＝5）

加入量，μg/ml 1.010.020.0測(cè)得量，μg/ml 0.94399.657318.3626回收率，%94.39±1.5795.57±2.2291.81±2.11日內(nèi)R SD，%1.662.301.15日間R SD，%2.162.422.34

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)：按“2.1.4”項(xiàng)樣品制備方法制備同濃度樣品8份，按并依法測(cè)定LTG濃度。結(jié)果，樣品中LTG平均含量的RSD為1.89%，表明該法重復(fù)性良好。

2.1.9 干擾性試驗(yàn)：取臨床常用的抗癲癇藥卡馬西平、PB、苯妥英鈉、地西泮、氯硝西泮對(duì)照品適量，分別配制10.0 μg/ml的供試溶液，同時(shí)將上述所有對(duì)照品溶液與拉莫三嗪混合，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，卡馬西平、PB、苯妥英鈉、地西泮、氯硝西泮對(duì)拉莫三嗪的測(cè)定均不產(chǎn)生干擾。另外，丙戊酸（VPA）分子結(jié)構(gòu)中缺乏特征的紫外光譜吸收，用高效液相色譜法不能直接測(cè)定，因此，在本試驗(yàn)條件下，VPA對(duì)拉莫三嗪的測(cè)定無(wú)影響。

2.2 LTG血藥濃度相關(guān)結(jié)果分析

2.2.1 樣品采集：測(cè)定穩(wěn)態(tài)時(shí)LTG的血藥谷濃度。患者于下一次服藥前抽取全血2～3 ml，置于普通采血管中，以離心半徑為8 cm、4000 r/min于室溫離心10 min，于－20℃冰箱保存待測(cè)。

2.2.2 分組及統(tǒng)計(jì)方法：將搜集的320例病例，按照LTG單用及聯(lián)用分為3組：?jiǎn)斡肔TG組、LTG+VPA組、LTG+PB組，依次定義為1、2、3組。結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用逐步回歸分析法評(píng)價(jià)分析影響LTG血藥濃度的各類因素；用相關(guān)分析論證LTG與VPA以及PB之間的相互作用。

2.2.3 人群分布特征：2012年7月－2013年6月我院LTG血藥濃度監(jiān)測(cè)患者總?cè)藬?shù)為320例。其中男性158例，女性162例，男女性別比例為0.98∶1；17～45歲患者中女性居多，1～16歲患者中男性所占比例大。從患者年齡看，1～16歲患者占52.5%，兒童為我院LTG血藥濃度監(jiān)測(cè)患者中所占比例最大的人群；17～45歲青壯年患者占35.31%，屬于第二主體人群；46～75歲中老年患者所占比例最小，見(jiàn)表2。

表2 監(jiān)測(cè)患者人群性別與年齡分布（例）Tab 2 Population sex and age distribution of monitored patients（case）

2.2.4 LTG血藥濃度的影響因素：整理320例血漿樣本中LTG的含量及其可能的相關(guān)因素：性別、年齡、體質(zhì)量、LTG給藥劑量（mg/kg）、治療組類別（1組：LTG單藥治療組；2組：LTG+VPA聯(lián)合治療組；3組：LTG+PB聯(lián)合治療組）輸入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件以通過(guò)逐步回歸分析法逐步剔除或篩選影響LTG血藥濃度的因素（檢驗(yàn)水平為0.05）。結(jié)果顯示，LTG給藥劑量、聯(lián)用VPA、聯(lián)用PB可顯著影響LTG血藥濃度（P＜0.05），性別、年齡、體質(zhì)量則與其不存在顯著性的相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）（見(jiàn)表3）。將影響因素LTG給藥劑量、聯(lián)用VPA、聯(lián)用PB分別設(shè)定為自變量x1、x2、x3，LTG血藥濃度設(shè)為因變量y，得逐步回歸方程為：y＝0.6417 x1+2.5698 x2－2.0482 x3－0.2078；經(jīng)方差分析，P＜0.01。由此方程可知，LTG血藥濃度與LTG給藥劑量、VPA的影響呈正相關(guān)，與PB的影響呈負(fù)相關(guān)。即增大LTG給藥劑量或加用VPA可提高LTG的血漿水平，加用PB則能降低其血漿水平。

2.2.5 聯(lián)合應(yīng)用其他抗癲癇藥對(duì)LTG血藥濃度的影響：各組一般資料及藥物劑量與血藥濃度比較見(jiàn)表4。2組VPA劑量范圍為1.85～58.33mg/（kg·d）；3組PB劑量范圍為1.19～5.29mg/（kg·d）。其中PB聯(lián)合治療組的拉莫三嗪血藥濃度[（0.8±0.92）μg/ml]＜LTG單藥治療組[（3.02±2.55）μg/ml]＜VPA聯(lián)合治療組[（5.37±3.47）μg/ml]。應(yīng)用方差分析法比較3組血藥濃度，得到F值為0.0190，P＜0.01，表明各治療組間拉莫三嗪的血藥濃度存在著極顯著的差異。

表3 影響LTG血藥濃度的因素分析（n＝320）Tab 3 Analysis of influential factors of plasma concentration of LTG（n＝320）

表4 血漿樣本中拉莫三嗪的血藥濃度（±s，n＝320）Tab 4 Plasma concentrations of LTG in plasma samples（±s ，n＝320）

表4 血漿樣本中拉莫三嗪的血藥濃度（±s，n＝320）Tab 4 Plasma concentrations of LTG in plasma samples（±s ，n＝320）

組別1組2組3組例數(shù)14915813平均年齡，歲23.32±17.0819.73±15.957.85±5.27平均體質(zhì)量，k g 47.1±18.1646.3±20.2123.81±10.98 LT G平均維持劑量，mg/（k g·d）3.27±1.973.03±1.653.66±2.06 LT G平均血藥濃度，μg/ml 3.02±2.555.37±3.470.8±0.92

2.3 不同組別中藥物因素與LTG血藥濃度的相關(guān)性分析

2.3.1 LTG單藥治療組：LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關(guān)性：采用Pearson相關(guān)分析，對(duì)LTG給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，r＝0.119，P＞0.01。散點(diǎn)圖顯示，LTG血藥濃度隨著劑量的增加有上升趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

圖3 LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig 3 The scatter diagram of LTG dose and LTG plasma concentration

2.3.2 LTG與VPA聯(lián)合治療組：（1）LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關(guān)性。對(duì)LTG給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果r＝0.536，P＜0.01，表明LTG血藥濃度與LTG給藥劑量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。散點(diǎn)圖顯示，LTG血藥濃度隨著LTG給藥劑量的增加而增加，見(jiàn)圖4。（2）VPA給藥劑量與LTG血藥濃度的相關(guān)性。對(duì)VPA給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果r＝0.112，P＞0.01。散點(diǎn)圖顯示，LTG血藥濃度隨著VPA劑量的增加有上升趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。（3）VPA血藥濃度與LTG血藥濃度的相關(guān)性。對(duì)VPA血藥濃度與LTG血藥濃度之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果r＝0.206，P＜0.01，表明LTG血藥濃度與VPA血藥濃度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。散點(diǎn)圖顯示，LTG血藥濃度隨著丙戊酸血藥濃度的上升而上升，見(jiàn)圖6。

圖4 LTG給藥劑量與LTG血藥濃度的相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig 4 The scatter diagram of LTG dose and LTG plasma concentration

圖5 VPA給藥劑量與LTG血藥濃度的相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig 5 The scatter diagram of VPA dose and LTG plasma concentration

圖6 VPA血藥濃度與LTG血藥濃度的相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig 6 The scatter diagram of VPA plasma concentration and LTG plasma concentration

2.3.3 LTG與PB聯(lián)合治療組：對(duì)LTG給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果r＝0.320，P＞0.01。對(duì)PB給藥劑量與LTG血藥濃度之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果r＝0.040，P＞0.01。兩種結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于此組別中進(jìn)行苯巴比妥血藥濃度測(cè)定的樣本較少，故不便進(jìn)行PB血藥濃度與LTG濃度的Parson相關(guān)分析。

3 討論[1-6]

3.1 影響LTG血藥濃度的因素

LTG屬于苯基三嗪類化合物，是一種新型抗癲癇藥，具有弱的抗葉酸活性。鑒于其良好的抗癲癇作用，可用于各種癲癇的治療，也可單用或聯(lián)合添加使用。近年來(lái)，國(guó)外也有資料報(bào)道顯示LTG單藥治療部分性發(fā)作為主的成人及兒童癲患者也有較好的效果[1-2]。

本文特選取320例采用LTG治療的癲癇患者，通過(guò)逐步回歸分析法依次剔除或篩選影響LTG血藥濃度的因素，結(jié)果顯示LTG給藥劑量、聯(lián)合應(yīng)用VPA或PB對(duì)LTG血藥濃度影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從作用大小來(lái)看，聯(lián)合應(yīng)用VPA對(duì)LTG血藥濃度的影響最為明顯，其次為L(zhǎng)TG給藥劑量。從作用性質(zhì)來(lái)看，LTG血藥濃度與LTG給藥劑量、VPA的影響呈正相關(guān)，與PB的影響呈負(fù)相關(guān)，即增大LTG給藥劑量或者聯(lián)合應(yīng)用VPA可提高LTG血漿水平，而加用PB則可降低LTG的血漿水平。基于此，LTG的臨床治療不能僅僅通過(guò)給藥劑量而了解其血藥濃度。為了更好地實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，為患者制訂安全、合理、有效的治療方案，建立該藥的血藥濃度監(jiān)測(cè)工作必不可少。此外，體質(zhì)量對(duì)LTG血藥濃度的影響在國(guó)外文獻(xiàn)亦有報(bào)道，研究指出由于高體質(zhì)量患者體內(nèi)LTG的清除速率較慢因而血漿水平較高[3]。本文研究未出現(xiàn)此結(jié)果。

3.2 聯(lián)合用藥對(duì)LTG血藥濃度的影響

VPA與LTG聯(lián)合應(yīng)用是目前臨床治療難治性癲癇的主要方法。在藥效學(xué)方面，LTG可增強(qiáng)γ-氨基丁酸（GABA）能突觸后作用，VPA抑制興奮性氨基酸釋放，共同使膜電位趨于穩(wěn)定，兩藥抗癲癇機(jī)制互補(bǔ)。在藥動(dòng)學(xué)方面，90%的LTG主要通過(guò)與葡萄糖醛酸結(jié)合代謝，大約30%～50%的VPA也經(jīng)葡萄糖醛酸結(jié)合代謝，VPA可競(jìng)爭(zhēng)性抑制LTG與葡萄糖醛酸的結(jié)合，使LTG清除率下降，從而延長(zhǎng)LTG的半衰期，提高LTG的血漿水平。Gidal BE等[4]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，丙戊酸的血藥濃度在治療水平（50～120μg/ml）便顯著抑制LTG的清除率，VPA濃度超過(guò)20 μg/ml時(shí)對(duì)LTG的口服清除率的抑制程度最大。Paraskevas GP等[5]研究表明VPA與LTG合用臨床療效顯著，且血漿內(nèi)谷氨酸含量明顯降低，其效果優(yōu)于LTG單藥治療。

LTG在與具有肝酶誘導(dǎo)作用的藥物如PB、卡馬西平、苯妥英鈉合用時(shí)，其藥動(dòng)學(xué)可發(fā)生改變，半衰期縮短。臨床上聯(lián)合使用時(shí)，通常需要增加LTG的劑量[6]。本研究通過(guò)逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用其他抗癲癇藥是影響LTG血藥濃度的重要因素（P＜0.05）。LTG單藥治療組與2個(gè)聯(lián)合用藥組做F值檢驗(yàn)，顯示3組LTG血藥濃度有顯著差異（P＜0.01）。VPA治療組的LTG平均血藥濃度最高，LTG單藥治療組次之，PB治療組最低，表明加用PB可顯著降低LTG血藥濃度，加用VPA則能顯著升高其血藥濃度。

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