HPLC法測定患者血漿中氯吡格雷的羧酸代謝產物濃度

劉麗娜，夏泉，黃燕，許杜娟1，#（1.安徽醫科大學藥學院，合肥3003；.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，合肥 3003；3.國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，合肥 3003）

氯吡格雷（Clopidogrel）（結構式見圖1 A）是一種新型的噻吩并吡啶類衍生物，具有抗血小板聚集作用及抗血栓形成作用。其作用機制是通過選擇性地與血小板表面ADP受體結合來抑制血小板的聚集，目前已被廣泛應用于冠脈支架植入（PCI）術中、術后以預防急、慢性血栓形成[1]。氯吡格雷為前體藥，在體內約有85%被水解成無活性的羧酸氯吡格雷（CCA，結構式見圖1 B），而不足15%被代謝為活性的硫醇衍生物。此前藥及其活性硫醇衍生物極不穩定，且濃度極低，在血漿中用常規檢測方法很難檢測到[2]。CCA相比其前體藥和活性代謝產物，是氯吡格雷在體內的主要組成部分，常用于做氯吡格雷的生物等效性及藥動學研究[2-4]。本研究旨在建立用高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）法測定人血漿中CCA的濃度，該方法具有簡便、準確、靈敏度高等優點，為臨床應用及個體化治療方案提供參考。

1 材料

1.1 儀器

圖1 氯吡格雷及CCA結構式A.氯吡格雷；B.CCAFig 1 Chemical structures of clopidogrel and carboxylic acid metabolite of clopidogrelA.clopidogrel；B.carboxylic acid metabolite of clopidogrel

Ailgent 1100高效液相色譜系統，配DAD-G1315 B檢測器、1100色譜工作站（美國Ailgent公司）；AB135-5電子天平（上海梅特勒多-托利多公司）；XW-80 A旋轉振蕩器（上海醫科大學儀器廠）；TGL-185高速冷凍離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

1.2 藥品與試劑

CCA對照品（加拿大TRC公司，含量：98%，批號：3-JHY-32-3）；內標：苯妥英鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100210-200401）。甲醇、乙睛為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。健康人血漿由安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科提供，CCA血漿樣品取自安徽醫科大學第一附屬醫院門診及住院服用氯吡格雷的患者。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀（三乙胺調pH至5.7）-乙腈（78∶22）；流速：1.0 ml/min；柱溫：50℃；紫外檢測波長：220 nm；進樣量：20μl。

2.2 儲備液的配制

分別準確稱取CCA對照品和苯妥英鈉對照品適量，用甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為100 μg/ml的儲備液，置于4℃冰箱中保存備用。

2.3 血漿樣品預處理

精密吸取患者血漿200μl，置于1.5 ml具塞圓底塑料離心管中，加內標苯妥英鈉儲備液10μl，渦旋混勻2 min，加6%高氯酸50μl渦旋混勻2min。以離心半徑為8cm、14000r/min離心10 min，取上清液再次以離心半徑為8 cm、14000 r/min離心10 min，取上清液置于進樣瓶中，進樣20μl。

2.4 色譜行為

在“2.1”項色譜條件下，CCA和苯妥英鈉的保留時間分別為7.6、19.8 min。CCA和苯妥英鈉與血漿中其他組分色譜峰分離良好，理論板數為3000，分離度（R）＞1.5，色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+CCA+苯妥英鈉；C.患者血漿；1.CCA；2.苯妥英鈉Fig 2 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+CCA+phenytoin sodium；C.plasma；1.CCA；2.phenytoin sodium

2.5 標準曲線及線性范圍考察

用空白血漿將CCA儲備液稀釋成0.10、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/ml的系列溶液。按“2.3”項下方法處理并測定，記錄色譜。以血藥濃度（x）為橫坐標、所測藥物與內標峰面積的比值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程為：y＝0.1499 x+0.0551（r＝0.9995）。結果表明CCA血藥濃度在0.10～8.0 μg/ml范圍內線性關系良好，最低檢測限為0.05 μg/ml。

2.6 精密度試驗

分別配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3種質量濃度的含對照品血漿，每一質量濃度平行操作5份，于同日內按“2.3”項方法操作后進樣分析，計算日內精密度；連續5 d按此法操作，綜合5d的數據計算日間精密度。CCA日內、日間RSD均小于10%，方法精密度良好，結果見表1。

2.7 回收率試驗

2.7.1 方法回收率：分別配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3種質量濃度的含對照品血漿，按“2.3”項下方法操作，每一濃度平行操作5份后進樣分析，代入回歸方程計算濃度，以測得量和加入量的比值計算方法回收率。結果CCA的方法回收率在99.7%～100.2%之間，確保了定量的準確性和可靠性，見表1。

2.7.2 提取回收率：分別配制0.5、2.0、4.0μg/ml的CCA低、中、高3種質量濃度的含對照品血漿，按“2.3”項下方法操作，每一濃度平行操作5份后進樣分析。另配制與血漿中相同濃度的CCA對照品溶液，與樣品中含量相等的CCA比較，記錄峰面積計算提取回收率。結果提取回收率均大于75%，見表1。

表1 精密度與回收率試驗結果（n＝5）Tab 1Results of precision and recovery tests（n＝5）

上述結果表明，日內、日間RSD均小于3%，平均方法回收率在99.7%～100.2%之間，平均提取率均大于75%。該方法適用于本品血藥濃度檢測和藥動學研究。

2.8 凍融穩定性試驗

用空白血漿配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3種質量濃度的含對照品樣品，在－40℃冰箱中冷凍后取出，在0、24、48、72h后按“2.3”項下方法測定CCA的濃度。結果CCA低、中、高3種質量濃度測得值的RSD分別為1.0%、2.1%、1.18%，穩定性RSD均小于10%，表明樣品在－40℃條件下穩定。

2.9 患者血藥濃度檢測

從門診及住院病房共收集到15例PCI術后規律服用氯吡格雷75 mg/d超過7 d的患者，患者在當天早上服藥后3 h時采集血樣測其CCA血藥濃度，結果見表2。

表2 患者CCA血藥濃度測定結果Tab 2 Plasma concentration results of CCAin patients

3 討論

本研究建立了以HPLC-UV法測定血漿中羧酸氯吡格雷的濃度，方法專屬性高，方法回收率在99.7%～100.2%之間，提取回收率超過75%，穩定性RSD均小于10%，符合藥動學和生物等效性的要求[2-4]。因此測定CCA的血藥濃度可以對研究氯吡格雷體內過程以及指導氯吡格雷進行個體化給藥提供幫助。

氯吡格雷羧酸代謝產物的測定方法目前有HPLC法及液-質聯用（LC-MS/MS）法等。本研究使用HPLC法，其中流動相中用三乙胺調pH可增加儀器靈敏度。試驗過程中曾比較二氯甲烷、正乙烷、乙醚、6%高氯酸萃取CCA，發現6%高氯酸萃取率最高。與文獻報道[4]方法相比，本法具有以下特點：（1）樣品預處理較為簡單；（2）和文獻中1.7 ml/min的流速相比，該研究流速較低從而使CCA和血漿中雜質峰充分分離。

氯吡格雷藥物體內藥動學過程中，其吸收和代謝過程受ATP結合盒（ABCB）1及細胞色素P450酶（CYP）酶單核苷酸多態性（SNP）的影響，基因分型不同其CCA的血藥濃度也有所差別。另合并用藥的相互作用、年齡、體質量，患者生活習慣及肝腎功能也會影響其血液濃度[5]。

[1]Jolanta M，Siller-Matula，Katrin Haberl，et al.The effect of antiplatelet drugs clopidogrel and aspirin is less immediately after stent implantation[J].Thrombosis Research，2009，123（6）：874.

[2]Zydus Research Centre，Bioanalytical and DMPK Department，Sarkhej-Bavla N.H.Estimation of carboxylic acid metabolite of clopidogrel in Wistar rat plasma by HPLC and its application to a pharmacokinetic study[J].Journal of Chromatography B，2005，25（821）：173.

[3]Robinson A，Hilis J，Neal C，et al.The validation of a bioanalytical method for the determination of clopidogrel in human plasma[J].Journal of Chromatography B，2007，27（848）：344.

[4]Bahrami G，Mohammadi M，Sisakhtnezhad S，et al.Highperformance liquid chromatographic determination of inactive carboxylic acid metabolite of clopidogrel in human serum：application to a bioequivalence study[J].Journal of Chromatography B，2008，28（864）：168.

[5]Zhou HM，Meng S，Zhao J，et al.Influence of genetic and non-genetic factors on the plasma concentrations of the clopidogrel metabolite（SR26334）among Chinese patients[J].Clinica Chimica Acta，2013，416（1）：50.