基于陰離子型環糊精超分子包合物高靈敏熒光光度分光法檢測血漿中殘留亞甲藍Δ

周群剛，謝蓮，方敏，趙銘，唐建華，王明元，徐軍，謝洪平#（.蘇州大學醫學部藥學院，江蘇蘇州 53；.蘇州市中心血站，江蘇蘇州 5006）

為降低臨床上輸血感染病毒的風險，增加輸血的安全性，一般采用亞甲藍光化學法滅活血漿中的病毒[1]。在滅活病毒以后，需使用特制的濾器濾除85%以上的亞甲藍[2]，最大殘留量為0.2 μmol/L。為了保證用血安全，需要對血漿中亞甲藍的殘留量進行檢測。測定方法有化學發光法[3]、高效液相色譜法[4]及共振瑞利散射法[5]等，這些方法中，有的靈敏度較低，有的需采用固相萃取富集后才能測定。在原衛生部編制的《血站技術操作規程（2012年版）》[6]中，利用小柱萃取富集預處理后以分光光度法檢測。但是，該方法檢測靈敏度仍然較低，大多數樣本的吸光度在《中國藥典》（2010年版）附錄方法所規定的0.3以下，預示著檢測結果不準確。同時，該方法不但操作繁瑣，而且需要大量的血漿，浪費寶貴的血漿資源。周群剛等[7]利用電中性的β-環糊精發展了一種亞甲藍增敏熒光分光光度法，以提高檢測靈敏度，實現了不經分離、富集直接測定血漿中亞甲藍，表現出了快速、簡單、需要血漿量少的優點。但是，該方法的最低定量限（0.089 μmol/L）與血漿中最大殘留量0.2 μmol/L非常接近，前者僅僅為后者的0.46倍，預示著該方法存在兩個問題：（1）檢測信號的絕對值較低，導致該方法對于大多數的實際檢測樣本的信噪比低；（2）樣本的實際殘留量極有可能低于該定量限，從而導致該方法不能用于有些實際樣本的檢測。本文利用陰離子型環糊精對亞甲藍熒光的增敏作用，建立了一種新的檢測血漿中殘留亞甲藍的方法。與之前方法相比該方法檢測限低、靈敏度高、操作簡便，具有一定的創新性和應用價值。

1 材料

1.1 儀器

LS-55熒光分光光度計（美國Perkin Elmer公司）。

1.2 藥品與試劑

亞甲藍（上海TCI公司，純度＞98.5%）；羧甲基-β-環糊精（山東濱州智源生物科技有限公司，純度＞98%）；其他試劑均為分析純。蘇州市中心血站提供8份非滅活混合人血漿約1000 ml，使用一次性病毒滅活配套裝置中的過濾器濾除白細胞，得不含亞甲藍的血漿，即空白血漿；同時提供20份經亞甲藍病毒滅活的成品血漿樣本，即待測血漿。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

稱取亞甲藍0.0745 g，置于100 ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）溶解并稀釋至刻度。準確量取5.00ml，用PBS定容到100 ml，得貯備液（100μmol/L），避光、密封保存。

2.2 血漿樣品的制備

向420μl的待測血漿中加入344μl的羧甲基-β-環糊精飽和溶液（0.01 mol/L），使羧甲基-β-環糊精濃度為4.5 mmol/L，充分混勻，避光放置20 min，即得待測溶液。同時，用空白血漿按前述方法配制不含亞甲藍的待測溶液，即得空白溶液。

2.3 熒光分光光度法測定血漿中亞甲藍含量

將待測溶液（或空白溶液）置于熒光比色皿中，以665 nm為激發波長、680 nm為發射波長、激發狹縫寬度5 nm、發射狹縫寬度5 nm、激發光程2 mm、發射光程10 mm，測定其熒光強度，由標準曲線計算亞甲藍含量。

2.4 線性關系考察

用亞甲藍貯備液和空白血漿分別配制含亞甲藍濃度為0.008、0.05、0.08、0.15、0.20μmol/L的5個標準血漿。利用羧甲基-β-環糊精溶液（0.01 mol/L），按“2.1”項下方法配制標準待測溶液，再按“2.3”項下方法測定標準待測溶液的熒光強度。以扣除空白的待測溶液的熒光強度為依據，即ΔF＝F－F0（其中，F和F0分別為待測溶液和空白溶液的熒光強度），對相應的亞甲藍濃度（c）進行線性回歸，得回歸方程為ΔF＝73.898 c－0.0734（r＝0.9990）。結果表明，亞甲藍血藥濃度在0.008～0.2μmol/L范圍內線性關系良好。

2.5 包合反應時間

對于含亞甲藍相同濃度的6個樣本，室溫避光，經不同包合反應時間后，測定其熒光強度（見圖1）。從圖1可知，室溫下反應20 min后體系熒光強度趨于穩定，20、40、60、120 min熒光強度的相對標準偏差（RSD）為0.57%，熒光至少穩定2h。因此本試驗采用反應20 min后測定。

圖1 亞甲藍熒光強度隨時間的變化Fig 1 Change of fluorescence intensity of methylene blue with time

2.6 精密度試驗

利用空白血漿和亞甲藍貯備液，按“2.1”項下方法配制含亞甲藍0.2、0.08、0.008 μmol/L的3個高、中、低濃度的待測溶液，按“2.3”項下方法測定其熒光強度。對同一個樣本在同一天內測定11次，以測得的熒光強度計算日內RSD；對同一個樣本連續測定11 d，以測得的熒光強度計算日間RSD。結果表明，該方法具有良好的精密度，結果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.7 回收率試驗

利用空白血漿和亞甲藍貯備液，按“2.1”方法分別配制含亞甲藍0.2、0.08、0.008 μmol/L的3個高、中、低濃度的待測溶液，按“2.3”項方法測定其熒光強度。以每個樣本連續測定5次的熒光強度的平均值按“2.4”項下回歸方程計算亞甲藍濃度，并據此計算回收率，結果見表1。該結果表明本文所建立的方法具有良好的回收率。

2.8 實際血漿樣本中亞甲藍殘留量檢測

取20份待測血漿，按“2.1”項方法對每份血漿配制3個平行待測溶液，測定熒光強度。以空白溶液3次測定的平均熒光強度為標準，計算ΔF。按回歸方程計算相應的亞甲藍殘留量，（見表2）。結果表明，20個實際血漿樣本中亞甲藍的含量均在線性范圍內，且低于最大規定殘留量0.2 μmol/L。由此說明本方法對于實際的成品血漿能夠實現亞甲藍殘留量的準確檢測，并表現出快速、簡單、低血漿消耗的顯著特點。而基于β-環糊精的熒光分光光度法[7]，最低定量限為0.089 μmol/L，20個實際血漿樣本中僅有8個樣本亞甲基藍濃度在線性范圍內，因此用這種方法僅有40%的實際樣本能得到準確檢測。

表2 實際血漿樣本中亞甲藍殘留量Tab 2 The residual quantity of methylene blue in actual plasma sample

3 討論

3.1 羧甲基-β-環糊精對亞甲藍熒光的增敏作用

由于β-環糊精與亞甲藍能夠形成超分子包合物而增強亞甲藍的熒光強度，據此已經建立亞甲藍的增敏熒光法[7]。β-環糊精與亞甲藍形成包合物的驅動力主要是疏水作用力[8]，而陰離子型的羧甲基-β-環糊精與陽離子型的亞甲藍之間的相互作用，除了疏水作用力外，還存在靜電相互作用，這種較強的作用力預示著對亞甲藍的增敏作用將更為顯著。從圖2可見，PBS緩沖溶液和羧甲基-β-環糊精對空白血漿的基底熒光沒有顯著影響，其強度均近乎為0（曲線a和b）；然而，羧甲基-β-環糊精對亞甲藍的熒光確表現出了顯著的增強作用，為84%（曲線c和d）。相對于β-環糊精的增敏作用[7]，羧甲基-β-環糊精的熒光增強使本文建立方法的靈敏度獲得了進一步提高（約為前者的10倍）。

圖2 羧甲基-β-環糊精對亞甲藍熒光的增敏作用a.空白血漿和 PBS；b.空白血漿+羧甲基-β-環糊精；c.空白血漿、亞甲藍+PBS；d.空白血漿、亞甲藍+羧甲基-β-環糊精）Fig 2 Sensitizing effect of CM-β-CD on the fluorescence signal of methylene blueA.blank plasma and PBS；B.blank plasma and CM-β-CD；C.blank plasma，methylene blue and PBS；D.blank plasma，methylene blue and CM-β-CD

3.2 羧甲基-β-環糊精濃度的影響

在含相同濃度亞甲藍的血漿樣本中，加入不同濃度的羧甲基-β-環糊精飽和溶液，使其濃度在0～5 mmol/L范圍內，測定其熒光強度（見圖3）。結果當羧甲基-β-環糊精濃度較低時，隨著其濃度的增加，亞甲藍熒光強度顯著增強；當血漿中羧甲基-β-環糊精的濃度為4.5 mmol/L時，熒光強度最高，表明較高濃度的亞甲藍已經被羧甲基-β-環糊精完全包合；繼續增加羧甲基-β-環糊精，熒光反而有所下降。因此，優化的羧甲基-β-環糊精濃度為4.5 mmol/L。

4 結語[8]

圖3 羧甲基-β-環糊精濃度對亞甲藍熒光強度的影響Fig 3 The influence of CM-β-CD on the fluorescence intensity of methylene blue

本文基于羧甲基-β-環糊精超分子包合物熒光光度法，建立了靈敏檢測血漿中殘留亞甲藍的方法。結果證明，該方法準確可靠，不需分離富集，檢測所需血漿量較少，可用于血漿中殘留亞甲藍的快速檢測；且相對于β-環糊精的增敏作用[7]，羧甲基-β-環糊精的熒光增強使本文建立方法的靈敏度約為前者的10倍。

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