李 樂，張興樂，王 鵬，劉 雨

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

成釉細(xì)胞瘤(AB)是常見的牙源性腫瘤，其在亞洲和南美洲人群的牙源性腫瘤中分別占48.7%及29.19%［1，2］。AB 被認(rèn)為是一種良性腫瘤，但它極易侵犯周圍組織，并有較高的復(fù)發(fā)率［3］。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一組細(xì)胞內(nèi)糖蛋白，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和黏附分子，在細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、增殖過程中發(fā)揮重要作用。研究［4］發(fā)現(xiàn)，β-catenin在AB的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本研究采用RT-PCR方法對(duì)AB組織中的β-catenin mRNA進(jìn)行了檢測(cè)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2007～2012年承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的AB組織8例份，均經(jīng)病理檢查證實(shí)，全部為濾泡型AB。10例份牙源性角化囊性瘤(KCOT)組織及6例份正常口腔黏膜組織(取自唇腭裂手術(shù)患者)。

1.2 β-catenin mRNA的檢測(cè) 采用 RT-PCR法。①總RNA的提取:用TRIzol提取各受檢組織的總RNA，干燥后加入DEPC處理水20 μL。用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)260 nm和280 nm處的紫外吸收值，重復(fù)測(cè)定3 次，計(jì)算 A260/A280，A260/A280＞1.8時(shí)，表明所提取的RNA純度高，可用于逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)A260計(jì)算RNA濃度。②引物合成:根據(jù)文獻(xiàn)及GenBank提供的RNA序列確定引物，β-catenin的正向引物為 5'-TGGCCTGGTTTGATACTGACCT-3'，反向引物為5'-CTCTACAGGCCAATCACAATG-C-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為382 bp。內(nèi)參照β-actin的正向引物為5'-ATCATGTTT GAGACCTTCAACA-3'，反向引物為5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為318 bp。③RT-PCR反應(yīng)體系及條件:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用20 μL體系:Oligo dT 1 μL，細(xì)胞總RNA 0.5 μg ，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，DEPC 處理DDW 至13 μL，混合后加熱至75℃，5 min后移至冰上使其迅速冷卻。快速離心后加入5×buffer 4 pL，加熱至42℃，2 min后加入逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，42℃保溫50 min后，70℃、15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)體系為25 μL(10 × buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dN TP 2 μL，目的序列上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，Taq 酶 0.5 μL)。反應(yīng)條件:94 ℃、2 min，94 ℃、40 s，58 ℃、40 s，72 ℃、60 s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。④ PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和分析:取5 μL的PCR產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳30～50 min，紫外燈下照相，用凝膠成像處理系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性片段進(jìn)行掃描，以β-actin密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，目的基因β-catenin mRNA的表達(dá)量以 β-catenin mRNA與 β-actin mRNA密度之比來表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

AB組織、KCOT組織、正常口腔黏膜組織中β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為 1.333±0.258、1.378 ± 0.211、0.952 ± 0.300;AB 組織和KCOT組織中β-catenin mRNA的表達(dá)量與正常口腔黏膜組相比，P均＜0.05;AB組織和KCOT組織中β-catenin mRNA的表達(dá)量相比，P＞0.05。見圖1。

3 討論

圖1 AB組織、KCOT組織、正常口腔黏膜組織中β-catenin mRNA的表達(dá)

AB的局部侵襲機(jī)制尚不完全明了，細(xì)胞增殖活性的增加可能對(duì)此起了一定作用［5，6］。有研究［7］提示，AB的侵襲性可能依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和其抑制因子(TIMPs)之間的平衡與調(diào)節(jié)，同時(shí)與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路有關(guān)。β-catenin是近年來發(fā)現(xiàn)的一組具有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和黏附功能的細(xì)胞內(nèi)糖蛋白，在細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、增殖過程中發(fā)揮重要作用［7］。人類β-catenin基因又稱CTNNB1基因，是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為92 000 D的胞質(zhì)蛋白，作為一種連接黏附蛋白和肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架蛋白，不僅在細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)、形態(tài)形成以及黏附等方面起重要作用，而且是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游元件，其介導(dǎo)的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［8］。β-catenin能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)MMPs的表達(dá)和活性，從而提高腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［9］。有研究［10］提示，在 AB 的腫瘤間質(zhì)和腫瘤細(xì)胞中都有β-catenin的表達(dá)。鐘鳴等［11］采用免疫組化法檢測(cè)72例AB患者瘤組織中的β-catenin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-catenin在AB組織的外周層及星網(wǎng)狀層細(xì)胞的膜、漿膜或胞質(zhì)中表達(dá)，異常表達(dá)率達(dá)87.5%，而且β-catenin在19例份 AB組織中出現(xiàn)了核的異位表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，β-catenin mRNA在AB組織和KCOT組織中的表達(dá)顯著高于正常口腔黏膜組織。β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與T細(xì)胞因子(TCF)或淋巴促進(jìn)因子(LEF)相結(jié)合，在其他因子的輔助下協(xié)同激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。其靶基因COX-2、Cyclin D1、間質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色［8］。

總之，與正常口腔黏膜組織相比，AB組織中β-catenin mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與KCOT組織中的表達(dá)量相近，其在AB組織中的異常表達(dá)可能與AB的發(fā)生發(fā)展及其生物學(xué)行為有關(guān)密切相關(guān)，可作為AB的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的一個(gè)指標(biāo)。

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