腺病毒介導的IL-10基因對1型糖尿病發病早期NOD鼠胰島β細胞的保護作用

李 誠，林曉杰，陳燕燕，張麗娟，李 堂

(青島大學附屬醫院，山東青島266003)

1型糖尿病(T1DM)是因機體胰島素絕對缺乏導致血糖持續升高的一類糖尿病。機體免疫功能紊亂致胰島β細胞凋亡，是本病的重要發病機制之一，多種免疫細胞及細胞因子參與了上述過程。其中，輔助性T細胞(Th)亞群的失衡受到越來越多的關注。Th細胞主要分為Th1、Th2兩大亞群。Th1 主要分泌 IL-1、IL-2、IL-12、IFN-γ 、TNF-α等，參與細胞免疫、介導炎性反應及胰島β細胞的凋亡。Th2主要分泌 IL-4、IL-10、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13等，參與體液免疫、誘導免疫耐受。Th1亞群比例升高、Th2亞群比例降低誘導并加重胰島 β 細胞凋亡，介導 T1DM發生［1］。IL-10為Th2分泌的重要細胞因子，具有免疫抑制及抗凋亡作用［2～4］。我們在前期研究中成功構建了有IL-10基因的重組腺病毒(Ad-mIL-10)［5］，并已證實IL-10對體外培養的胰島β細胞具有保護作用，且 IL-10可預防 NOD鼠 T1DM 的發生［6］。而IL-10在藥物誘導發病的NOD鼠胰島β細胞的保護方面，未取得理想結果，但并不排除誘導藥物對實驗結果的影響［7］。2012年11月1日～2013年1月15日，我們利用 T1DM自然發病 NOD鼠，觀察了Ad-mIL-10對其早期殘存胰島β細胞的保護作用。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及材料 7～9周齡雌性 NOD/Lt小鼠(清潔級)30只，體質量19～21 g，生產許可證號:SCXK(京)2009-0004，購于中國醫學科學院實驗動物研究所，25周齡時T1DM自然發病率達70%以上，將其置于青島大學附屬醫院動物房(環境為SPF級)飼養。全部小鼠自由飲食飲水，密切觀察小鼠是否存在多飲、多尿、多食、毛發無光澤或生命活力下降等表現，每周定時測定小鼠尿糖、體質量、血糖;用代謝籠收集小鼠尿液，用半定量尿糖試紙粗略檢測小鼠尿糖，當尿糖陽性時，采集小鼠尾靜脈血，測血糖，當連續2次小鼠尾靜脈血血糖≥13.9 mmol/L時，診斷為糖尿病。人胚腎293細胞由青島大學羅兵教授惠贈。Ad-mIL-10由青島大學附屬醫院陳志紅教授惠贈，病毒滴度為1.0×109pfu/mL。快速檢測腺病毒感染性滴度試劑盒購自北京本元正陽公司。鼠IL-4、IL-10、IFN-γ、C肽的ELISA試劑盒來自美國R＆D公司。DAB顯色試劑盒來自福州邁新生物技術開發公司。血糖儀為美國強生穩豪型。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 選取17～20周齡近期發病(診斷為T1DM不超過3 d)的雌性NOD小鼠12只，隨機分為A、B組(各6只);另選取相同周齡未發病的NOD鼠6只為C組。

1.2.2 動物處理、觀察及標本采集 A組發病后立即予腹腔注射0.1 mL的Ad-mIL-10，B、C組未予任何干預。實驗前(T1DM發病時)及實驗開始后第1、2、3周記錄小鼠體質量、尿糖及血糖。實驗第3周時處死全部小鼠，采用摘眼球法取全血，制備血清，-20℃冰箱保存;取胰腺，甲醛固定，做病理切片，備做HE及免疫組化染色。

1.2.3 胰腺局部IL-10檢測 采用SABC法觀察胰腺局部IL-10的表達情況。在400×高倍鏡視野下，每張胰腺切片連續觀察5個胰島，胞質內含有棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞。依據陽性細胞所占百分比及胞質內顆粒著色強度不同，給予不同評分:陽性細胞＜1%計0分、1%～10%計1分、11%～50%計2分、51%～80%計3分、＞80%計4分;細胞無著色計0分、淡黃色計1分、黃色計2分、棕黃色計3分。

1.2.4 胰島炎程度評定 胰腺切片HE染色。由專業病理人員觀察并進行雙盲法判定。胰島炎浸潤程度分級:0級為胰島完整，沒有淋巴細胞浸潤;1級為淋巴細胞浸潤胰島周圍或＜25%的胰島面積受累;2級為淋巴細胞浸潤25%～50%的胰島;3級為淋巴細胞浸潤＞50%的胰島［8］。在400×高倍鏡視野下連續觀察5個胰島組織的炎癥程度，統計各級胰島組織個數。

1.2.5 血清 IL-10、IL-4、IFN-γ 檢測 用 ELISA 法檢測上述-20℃冰箱保存的血清中的IL-10、IL-4、IFN-γ的 OD值，計算出相應的濃度值，并計算IFN-γ/IL-4，以評估Th細胞亞群狀態。

1.2.6 血清C肽檢測 采用 ELISA法檢測上述-20℃冰箱保存的血清中的C肽OD值，并計算出相應濃度值。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料進行正態檢驗及方差齊性分析，若不符合正態分布及方差不齊，將數據進行Log/Ln/Sin/Sqrt轉換;對于正態分布計量資料，多組間的兩兩比較用單因素方差分析和LSD檢驗;對進行Log/Ln/Sin/Sqrt等轉換后仍不符合正態分布及方差不齊的數據進行Games-Howell檢驗及Kruskal-Wallis秩和檢驗;對等級資料行Kruskal-Wallis秩和檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組NOD鼠血糖及體質量比較 各組NOD鼠血糖及體質量比較見表1、2。

表1 各組NOD鼠血糖比較(mmol/L，±s)

表1 各組NOD鼠血糖比較(mmol/L，±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.05

組別血糖實驗前 實驗第1周 實驗第2周 實驗第3周A組 20.40±3.92Δ 21.02±8.98Δ 24.12±9.01Δ 26.97± 9.64Δ B 組 18.13 ±5.35Δ 19.72 ±8.65Δ 24.82 ±8.96Δ 26.35 ±11.09Δ C組5.17 ±1.56 6.18 ±0.32 6.25 ±0.87 6.30 ± 1.38

表2 各組NOD鼠體質量比較(g，±s)

表2 各組NOD鼠體質量比較(g，±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.05

組別體質量實驗前 實驗第1周 實驗第2周 實驗第3周A 組 24.24 ±2.79 24.53 ±2.64 24.15 ±3.61 22.86 ±1.87Δ B 組 23.15 ±1.73 23.99 ±2.07 24.71 ±1.65 24.32 ±2.14 C 組 23.90 ±2.27 24.87 ±2.99 25.54 ±3.27 26.05 ±3.10

2.2 各組NOD鼠IL-10在胰腺局部的表達比較A組染色最深，著色顆粒在胰島內分布最廣;B組和C組染色較淺，著色顆粒在胰島內分布稀疏。SABC法染色陽性細胞計分和染色強度計分的乘積A組為5.62 ±0.81、B 組為 1.50 ±0.54、C 組為 4.67 ±1.03。A、C組與 B 組相比，P 均 ＜0.01;A、C 組相比，P ＞0.01。

2.3 各組NOD鼠胰島炎程度比較 各組NOD鼠各等級胰腺炎的胰島數量見表3;A、B組與C組相比，P 均 ＜0.01;A、B 組相比，P ＜0.05。

表3 各組NOD鼠各等級胰腺炎的胰島數量(個)

2.4 各組 NOD 鼠血清 IL-10、IL-4、IFN-γ、C 肽水平及IFN-γ/IL-4比較 檢測結果見表4、5。

表4 各組NOD鼠血清IL-4、IFN-γ水平及 IFN-γ/IL-4 比較(±s)

表4 各組NOD鼠血清IL-4、IFN-γ水平及 IFN-γ/IL-4 比較(±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.01;與B 組相比，#P ＜0.01

組別 IFN-γ(pg/mL) IL-4(pg/mL) IFN-γ/IL-4 A 組 295.62 ±20.29Δ# 45.06 ±1.48Δ# 6.56 ±0.46Δ#B 組 476.72 ±27.12Δ 34.58 ±2.40Δ 13.84 ±1.21Δ C組234.42 ±28.44 78.72 ±5.89 2.99 ±0.43

表5 各組NOD鼠血清IL-10、C肽水平比較(±s)

表5 各組NOD鼠血清IL-10、C肽水平比較(±s)

注:與 C 組相比，ΔP ＜0.01;與B 組相比，#P ＜0.01

組別 IL-10(pg/mL) C肽(ng/mL)A 組 183.02 ±11.40Δ# 4.491 ±0.338Δ#B組 124.95± 9.49Δ 3.296±0.328Δ C組255.96 ±31.10 7.050 ±0.500

3 討論

T1DM是一種器官特異性自身免疫病。機體免疫功能紊亂包括自身抗體的產生、免疫細胞的活化、炎性因子的釋放等。目前，針對T1DM的免疫治療主要集中在抗原特異性免疫治療、免疫抑制劑、免疫因子等方面，但上述方法大多未能通過Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗。其原因可能有以下幾方面:胰島自身抗原種類繁多，免疫紊亂機制復雜;人體耐受劑量低于藥物的有效治療劑量，藥物不良反應多;干預時機難于把握，一些患者起病時胰島β細胞已損傷殆盡，臨床很難做到早期干預;動物實驗中T1DM模型不能完全模擬人自然發病過程等因素也限制了免疫治療在T1DM臨床中的應用。

IL-10主要由Th2細胞分泌，具有以下作用:①IL-10可以下調單核-巨噬細胞、樹突細胞表面主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅱ類分子及協同刺激分子的表達，降低其抗原提呈作用［2］。②IL-10可促進巨噬細胞表面清道夫受體的表達，增強巨噬細胞的吞噬活性。③IL-10可抑制已經活化的抗原提呈細胞分泌炎性因子(IL-1、IL-12、TNF等)及趨化因子［9，10］。④IL-10可以抑制前列腺素 E2的表達，抑制樹突細胞的分化和成熟［11］。⑤IL-10可通過抑制抗原提呈細胞的作用，間接抑制 T細胞功能［12，13］。同時，IL-10可直接啟動T細胞內抑制性信號轉導通路。⑥IL-10可通過抑制Fas表達，發揮抗凋亡作用［3，4］。基于 IL-10 的上述作用，應用外源性 IL-10抑制T1DM患者胰腺過度的炎性反應，保護機體殘存胰島β細胞功能，成為可能。本研究結果顯示，A組胰腺局部IL-10表達及血清IL-10水平明顯高于B組，提示給予外源性IL-10，其可在胰腺局部高表達，且能在NOD鼠體內產生IL-10。

機體免疫系統是個復雜的龐大網絡，免疫細胞及免疫分子間相互協調，相互制衡。Th1/Th2淋巴細胞亞群失衡是導致 T1DM發病的關鍵環節［1］。Th1細胞分泌多種炎性因子，其中 IL-1、IFN-γ及TNF-α在胰島β細胞的殺傷過程中起重要作用。Th2細胞可分泌多種細胞因子，其中IL-4可阻止炎性細胞的趨化過程，促進Th2細胞的增殖，抑制細胞免疫反應。本研究結果顯示，與C組相比，B組血清IFN-γ水平升高，IL-4降低，IFN-γ/IL-4升高，提示T1DM自然發病的NOD鼠出現了明顯的Th1/Th2淋巴細胞亞群失衡現象。發病后，立即予Ad-mIL-10干預，A組血清 IFN-γ水平明顯降低，IL-4明顯升高，IFN-γ/IL-4降低，但未達 C組水平。提示Ad-mIL-10干預，可增強T1DM早期發病NOD鼠Th2細胞功能，抑制Th1細胞功能，部分逆轉Th1/Th2細胞失衡狀態。

C肽是胰島素原生成胰島素時的副產物，可反應胰島β細胞功能，是評估殘存胰島β細胞功能的重要指標，對延緩T1DM并發癥的出現具有重要作用［14］。因此，早期維持患者C肽高水平，十分必要。本研究結果顯示，C組C肽水平最高，B組最低，予Ad-mIL-10干預后，A組C肽水平升高。提示IL-10干預部分改善了胰島β細胞功能，對間接促進胰島素分泌有一定作用。

與人類T1DM發病機制相似，自然發病的NOD鼠胰腺內出現明顯的樹突細胞、巨噬細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞等炎性細胞浸潤。本研究結果顯示，IL-10基因干預無減輕胰島炎作用，在控制T1DM發病NOD鼠血糖及體質量方面也無明顯作用。原因有以下幾方面:T1DM的發病機制復雜，單一免疫抑制劑不能達到理想效果;IL-10在該劑量作用下，不能減輕胰島炎，不能有效控制血糖。

總之，IL-10基因干預，對T1DM自然發病NOD鼠，可使其體內 IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4降低，發揮一定的免疫調節作用;IL-10基因干預，可增加T1DM自然發病NOD鼠血清C肽水平，一定程度上改善胰島β細胞功能。該劑量單一IL-10基因干預，無減輕胰島炎及控制血糖作用。

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