百草枯致肺纖維化大鼠肺組織中Smo、Gli1的表達變化及意義

周媛媛，曾凡軍

(1三峽大學第一臨床醫學院，湖北宜昌443000;2宜昌市中心人民醫院)

百草枯(PQ)是聯吡啶類除草劑，中毒后出現的不可逆的肺間質纖維化是主要致死原因，病死率高達80%，但中毒機制不明。Sonic hedgehog(SHH)信號途徑是肺臟結構形成和發育過程中重要的信號轉導途徑［1］，其在肝、腎等器官纖維化過程中均存在異常活化現象［2］。SHH途徑是否參與PQ所致肺纖維化目前尚不清楚。Smo和Gli1是SHH途徑的2個重要分子［3～5］，本研究通過檢測 PQ致大鼠肺纖維化后Smo和Gli1的表達，探索SHH信號途徑在PQ致大鼠肺纖維化中的作用，進一步了解PQ致肺纖維化的中毒機制。

1 材料與方法

1.1 材料 PQ農藥購于鄭州沙隆達植物保護技術有限公司(農藥登記證號:PD20090712)。雄性SD健康大鼠40只，來自三峽大學醫學院實驗動物中心，SPF 級，體質量(255±25)g。

1.2 分組及模型制備方法 40只雄性SD大鼠隨機分為2組:PQ組、生理鹽水對照組(NS組)，每組20只。PQ組一次性腹腔注入PQ農藥40 mg/kg;NS組一次性腹腔注射生理鹽水40 mL/kg。21 d后處死大鼠，開胸取右肺組織。

1.3 大鼠肺組織病理組織學檢查 觀察兩組大鼠肺組織外觀后，石蠟切片HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.4 Smo和Gli1免疫組化檢測 采用SP法。免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司，免疫組化檢測嚴格按試劑盒說明書進行操作。組織脫蠟，0.3%H2O2阻斷過氧化酶活性;抗原熱修復處理后;以稀釋的兔抗Smo和Gli1多克隆抗體孵育過夜，陰性對照用PBS代替一抗，二抗采用山羊SABC過氧化物酶試劑盒，再用DBA試劑盒顯色。按照肺組織細胞胞膜及胞質或胞核出現的黃色、棕黃或褐色顆粒作為染色強度判斷標準，并結合著染細胞和組織分布范圍大小，綜合整個切片，雙盲法由2位病理科醫生對每張切片染色結果獨立進行評估:無表達(-)、弱表達(±)、低表達(+)、中表達(++)、高表達(+++)。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩變量間的相關性檢驗采用Spearman等級相關分析法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

NS組大鼠肺臟外觀肺組織色澤紅潤，表面光滑，彈性好。光鏡觀察未出現明顯病理改變。PQ組大鼠肺臟外觀肺組織呈蒼白色，表面凹凸不平、呈結節樣改變及條索狀凹溝，體積縮小，硬度增加。光鏡觀察發現肺組織部分實變，肺泡結構破壞，部分肺泡腔消失，為大量膠原纖維、成纖維細胞增生。見圖1。

2.1 Smo和Gli1檢測結果 Smo和Gli1蛋白主要分布于支氣管上皮、肺泡上皮、血管內皮細胞及部分纖維組織。Smo陽性表達主要定位于細胞膜及胞質，Glil陽性表達主要定位于胞質及胞核。Smo及Gli1在NS組無表達或弱表達，在PQ組表達明顯增強，兩組比較 P＜0.01。見圖2、表1。

圖1 兩組大鼠肺組織光鏡檢查結果

圖2 Smo和Gli1在兩組大鼠肺組織中的表達

表1 兩組大鼠肺組織中Smo和Gli1蛋白的免疫組化表達水平(例)

2.2 Smo和Gli1的相關性分析 PQ組Smo及Gli1蛋白的表達呈正相關(r=0.956，P ＜0.001)。

3 討論

PQ是有機雜環類除草劑，對人畜具有很強的毒性，病死率極高。機體中毒后出現不可逆性肺間質纖維化［6，7］。但其發病機制尚未完全明確，可能與過度氧化反應及基因表達異常有關。目前對PQ所致肺纖維化尚無特異性治療方法。因此，研究PQ所致肺纖維化機制不僅可以闡明肺纖維化發病的機制，而且對PQ中毒的治療有重要價值。

SHH途徑是動物體內存在的重要信號途徑。主要由Hedgehog配體(Shh)、2個膜受體Ptch、Smo及下游的轉錄因子Gli組成［8］。Smo和Gli1是SHH途徑的2個重要分子;Smo蛋白是信息轉換器，它能夠將細胞外的SHH信號轉換成細胞內的Gli1信號，對SHH信號途徑具有激活作用。有研究［10］顯示，活化的SHH信號與組織纖維化具有密切關系。

本研究發現，腹腔注入PQ的大鼠肺臟呈明顯肺纖維化的病理改變，且較注入生理鹽水組大鼠肺組織Smo和Gli1蛋白表達明顯增強。PQ組Smo及Gli1蛋白的表達呈正相關。由此推斷，PQ所致肺纖維化與SHH信號被激活有密切關系，但不清楚激活的SHH信號通過何種機制影響肺纖維化進程。推測可能與 PQ激活 SHH信號途徑，SHH蛋白和Patch蛋白結合后，Patch對Smo抑制解除，通過胞質微管上附著的hedgehog信號復合物介導，使轉錄因子Gli1進入胞核，激活其下游基因表達［11］，導致肺組織纖維化。

可見，SHH信號途徑的異常激活可能直接參與了PQ所致肺纖維化的發生、發展過程，而Smo和Gli1蛋白明顯表達則可能是SHH信號途徑異常激活的機制之一。進一步研究SHH信號途徑在PQ致肺纖維化中的作用可能為PQ所致肺纖維化開辟新的治療途徑。

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