高效液相色譜法測定血清卡馬西平的優化方案

肖潤梅，郭珍立，孫敬智，陳 勇

(1湖北大學生命科學院湖北省生物技術省重點實驗室，武漢430062;2湖北省新華醫院)

卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)作為亞氨基二苯乙烯衍生物，是目前兒科臨床最常用的抗癲癇藥(Antiepileptic drugs，AEDs)之一，更是治療單純及復雜部分性發作的首選藥物［2］。由于其血藥濃度范圍窄，且存在明顯的個體差異，易發生不良反應［3］。為了提高臨床用藥的有效性和安全性，減少不良反應，需要對治療藥物卡馬西平進行監測。用高效液相色譜法測定血清抗癲癇類藥物的方法學研究已被廣泛報道［4］，但對實驗方法中樣品前處理各種因素的選擇較少報道。2013年2～5月，我們探討建立以高效液相色譜法測定人血清CBZ濃度的實驗方法優化方案。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 Waters 2695-2998高效液相色譜儀(配光電二極管陣列檢測器，美國Waters公司)，KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DK-450B型電熱恒溫水槽(上海深信實驗儀器有限公司)，HP-01系列溶劑過濾器、OHAUS萬分之一電子天平(德國Sartorious公司)，TDL80-2B型高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，XK96-B快速混勻器(姜堰市新康醫療器械有限公司)。本實驗中所用試劑除另有說明外均為分析純試劑，水為去離子水。甲醇(色譜純 J.T.Baker)，CBZ對照品(批號:100142-201105)，苯巴比妥對照品(批號:171222-200605)，苯妥英鈉對照品(批號:100210-201002)均購于中國藥品生物制品檢定所。乙酸乙酯(批號:T20110629)，乙醚(批號:20110412)均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的建立 色譜柱:Hypersil C18(200 mm ×4.6 mm，10 μm);采用梯度洗脫方式;二極管陣列檢測波長;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。

1.2.2 血清預處理方法 采集患者血液后37℃水浴30 min，2 000 r/min速度離心4 min，放置4℃冰箱冷藏待用［5］。

1.2.3 樣品預處理優化選擇 ①萃取溶劑的選擇:考察了乙醚、乙酸乙酯2種萃取劑對 CBZ的影響［6］，取0.2 mL 上清液分別與乙醚、乙酸乙酯各600 μL混合渦旋2 min，以3 500 r/min速度離心4 min，水浴中揮發至干，用1.0 mL流動相溶解殘留物，10 000 r/min離心20 min后進樣分析［7］。②樣品與萃取劑比例的選擇:取0.2 mL樣品上清液分別與0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 乙酸乙酯混合提取，考察不同體積比的樣品與萃取劑對萃取效率的影響。③萃取時間的選擇:將樣品與萃取劑混合后渦旋萃取，萃取時間選擇 3、6、9、12 min，考察不同萃取時間對萃取效率的影響。

1.2.4 工作曲線的繪制 CBZ標準儲備液:準確稱取CBZ對照品，用甲醇定容。配制成CBZ(2.468、4.937、7.406、9.875、12.344、24.688 μg/mL)標準液系列［8］，按樣品處理方法進行處理后，以外標法進行定量測定［9］。

1.2.5 檢出限計算方法 將高效液相色譜儀調節至最佳測定狀態，按研制的測定方法連續7次測定接近空白濃度的溶液，由測定值計算濃度平均值和標準差，以3倍的標準差所對應的濃度為檢出限［10］。

1.2.6 準確度和精密度計算方法 將血清樣品分成4組，一組為空白組值，其余三組經樣品處理后分別加入高、中、低3個濃度的標準溶液，每組6個樣品。測定后取平均值，減去空白組值，計算準確度和精密度［11］。

2 結果

2.1 流動相及洗脫程序 CBZ在梯度洗脫中流動相比例甲醇∶水 =61.3∶38.7，7.9 min 時出峰，其標準和樣品色譜圖見圖1、2。

圖1 CBZ標準品色譜圖

圖2 CBZ樣品色譜圖

2.2 樣品預處理的優化條件

2.2.1 萃取溶劑 乙酸乙酯提取樣品中CBZ的濃度為7.071 μg/mL，乙醚提取樣品中CBZ的濃度為9.674 μg/mL。

2.2.2 樣品與萃取劑體積比 不同體積比的樣品與萃取劑對萃取效率的影響見圖3。

圖3 樣品與萃取劑比例的選擇

2.2.3 萃取時間 萃取3、6、9、12 min時測得藥物濃度分別為 24.0、22.2、25.0、19.1 μg/mL。結果表明血清藥物濃度隨萃取時間的增加變化不大，萃取時間選擇為3 min。

2.2.4 標準曲線 測定組分CBZ的標準曲線見圖4。線性方程為 Y=3.79e+0.03X-8.80e+0.03，線性范圍為1.52～48.8 mg/L，線性關系良好，相關系數為0.999 1，可滿足測定需要。

2.2.5 檢出限 測得血清中CBZ的最低檢出濃度為0.4 mg/L。

2.2.6 準確度和精密度 血清中CBZ的準確度和精密度結果見表1。

圖4 CBZ標準曲線

表1 血清中CBZ的準確度和精密度

3 討論

流動相及洗脫程序的確定中CBZ的出峰時間在甲醇濃度為50%以后，保留時間較集中。由于梯度洗脫平衡柱子需要的時間長［12］，且實驗室考慮與做其他藥物血藥濃度測定的流動相比較相似，為了簡化液相流動相平衡的時間和實驗室便于記憶，所以將卡馬西平的流動相確定為甲醇∶水=60∶40的等度洗脫方式。二極管陣列檢測波長在210～400 nm，檢測波長為254 nm。

萃取溶劑的選擇中乙酸乙酯提取率/乙醚提取率為73.09%。實驗選擇乙酸乙酯做萃取劑主要基于以下幾點原因:①乙醚的低沸點易揮發特性使得用乙醚萃取的時候很難定量，實驗使用乙醚時為了定量必須萃取4次才能把血清中的藥物提取干凈。而用乙酸乙酯做萃取劑時容易定量，只需要提取1次，簡化了實驗。②水浴揮發乙酸乙酯將水浴溫度提高到75℃時，得到的產物與標準物質比對，其保留時間沒有改變，同時也沒有新物質生成。將水浴溫度56℃與75℃揮發所得產物濃度比較，沒有顯著性差別。說明提高水浴溫度對藥物性質和濃度沒有影響，克服了乙酸乙酯沸點高、揮發時間長的缺點。③乙酸乙酯對CBZ的提取率雖然比乙醚低，但是乙酸乙酯的的提取率/乙醚的提取率也達到73.09%，可以滿足臨床血藥濃度檢測的需要，因此實驗選擇乙酸乙酯做萃取劑。

萃取溶劑用量過少時，目標組分不能被充分萃入有機相，而溶劑用量過多時，則會導致樣品被稀釋，并延長揮發萃取液的時間［13］。考察了不同體積比的樣品(200 μL)與萃取劑對萃取效率的影響。綜合考慮組分的低、高濃度的萃取效率，選擇樣品與萃取劑的體積比為1∶3。高濃度的萃取濃度明顯隨著溶劑的增加增大，但是當樣品與萃取劑體積比例為1∶5時萃取濃度反而降低，分析是由于實驗使用1.5 mL的 EP 管，受到體積的限制，樣品(200 μL)與萃取劑比例為1∶5時(總體積為1.2 mL)的渦旋提取率明顯降低。

本文成功建立了以高效液相色譜法測定人血清CBZ濃度的優化方案，確定了最佳樣品預處理條件，優化了色譜分離及檢測條件，提高了檢測靈敏度。所建立的高效液相色譜法具有靈敏、準確、快速等特點，能夠滿足臨床治療中藥物濃度監測工作的要求。

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