宮頸病變組織中Vimentin、P16INK4A、Smad4的定位、表達及其在EMT中的作用

韓淑珍，熊 暉，王小英，陳小毅，王 森

(1廣東醫(yī)學(xué)院附屬厚街醫(yī)院，廣東東莞523900;2廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室;3廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，在導(dǎo)致婦女死亡的惡性腫瘤中占第二位，人乳頭瘤病毒(HPV)感染是子宮頸癌的首要病因。P16INK4A/Rb是HPV致癌作用的兩大重要途徑之一，P16INK4A基因在大部分惡性腫瘤中表達缺失，但在宮頸癌中表現(xiàn)為過表達，在宮頸癌中的具體作用尚不明確。P16INK4A高表達對宮頸癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有何影響目前尚無研究報道。我們觀察了Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸癌及前期病變中的定位與表達水平，探討其對宮頸癌細胞EMT的影響和可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年2月～2013年4月廣東醫(yī)學(xué)院附屬厚街醫(yī)院婦產(chǎn)科門診宮頸活檢病例共120例，其中慢性子宮頸炎、低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、高級別CIN和宮頸癌各30例。患者年齡16～78歲，中位年齡36歲。標本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)切片，分別做HE和免疫組織化學(xué)染色。CIN和宮頸癌病例術(shù)前均未接受放化療和其他針對腫瘤的治療，所有病例在厚街醫(yī)院病理科確認并復(fù)審。

1.2 主要試劑 APES購于福州邁新有限公司，PV-6000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、小鼠抗人單克隆抗體Vimentin(克隆號V9，批號18J1779A)和P16INK4A(克隆號G175-405)購于DAKO公司，小鼠抗人單克隆抗體Smad4(sc-7966)購自Santa Cruz有限公司。

1.3 Vimentin、P16INK4A和Smad4檢測方法 免疫組織化學(xué)染色按照PV-6000試劑盒說明書進行，采用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液進行高壓抗原修復(fù)，Smad4抗體工作濃度為1∶200，其余抗體為工作液。實驗中以已知陽性組織為陽性對照、PBS代替一抗作為空白對照。由兩人分別獨立對實驗結(jié)果進行雙盲法評估。光鏡觀察Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的表達定位。400×光鏡下計數(shù)至少400個腫瘤細胞，結(jié)果判斷:①按陽性細胞百分率計分:無陽性表達腫瘤細胞計0分;陽性細胞≤25%計1分;26%～50%計2分;≥51%計3分。②按染色強弱計分:無染色計0分;淡黃色計1分;黃色計2分;棕黃色計3分。兩項相乘，評分0分為陰性，1～4分為陽性，6～9分為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗，兩變量間的相關(guān)性檢驗采用Spearman等級相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vimentin、P16INK4A和 Smad4在宮頸病變組織中的定位 Vimentin、P16INK4A和Smad4在各宮頸病變組織中呈不同程度陽性表達，在細胞質(zhì)和細胞核均可表達。見圖1。

圖1 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的表達(×200)

2.2 Vimentin、P16INK4A和 Smad4在宮頸病變組織中的表達水平 見表1。

表1 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的陽性表達率(%)

2.3 宮頸病變組織中 Vimentin、P16INK4A和 Smad4表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Vimentin在慢性子宮頸炎、低級別CIN、高級別CIN和宮頸癌組織細胞質(zhì)和細胞核中的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)。P16INK4A在慢性子宮頸炎組織細胞質(zhì)和細胞核中表達為陰性，在低級別CIN、高級別CIN和宮頸癌組織細胞質(zhì)和細胞核中表達水平均增加(P均＜0.01)。Smad4在慢性子宮頸炎組織中細胞核與細胞質(zhì)均為高表達，細胞核中Smad4在低級別CIN、高級別CIN和宮頸癌組織中表達水平降低(P均＜0.01);Smad4在4者細胞質(zhì)中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Spearman相關(guān)分析顯示，120例宮頸病變組織中Smad4核表達與P16INK4A的核質(zhì)表達均呈負相關(guān)(r分別為 -0.274、-0.387，P 均 ＜0.01)，Smad4核表達與Vimentin核表達亦呈負相關(guān)(r=-0.209，P＜0.05)，P16INK4A核質(zhì)表達與Vimentin核表達均呈正相關(guān)(r分別為0.334、0.443，P 均 ＜0.01)。宮頸癌組織中Vimentin、P16INK4A和Smad4無論細胞核表達或細胞質(zhì)表達均與宮頸癌的分化和年齡無相關(guān)關(guān)系(P均＞0.05)。見表2。

表2 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的表達定位與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(%)

3 討論

EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。有研究［1］表明宮頸癌中存在著EMT，E-cadherin表達減少和Vimentin表達增高是宮頸癌浸潤進展的重要指標［2］。本實驗結(jié)果顯示，隨著宮頸病變程度的增加，Vimentin表達水平不斷增加;宮頸癌、高級別CIN組織Vimentin表達水平高于低級別CIN與慢性子宮頸炎組織，與其他學(xué)者的結(jié)果一致。本實驗中Vimentin在細胞核中表達高于細胞質(zhì)的表達，Spearman相關(guān)分析顯示Vimentin核表達與病變組織學(xué)類型相關(guān)，提示Vimentin核表達在宮頸癌的浸潤進展中起主要作用，這一結(jié)果與我們在鼻咽癌EMT 中的研究［3］相似。

P16INK4A是細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)抑制因子，在大部分惡性腫瘤中表達缺失，但在宮頸癌中P16INK4A表現(xiàn)為過表達。有學(xué)者［4］認為P16INK4A在宮頸癌中高表達僅僅是HPV抑制Rb負反饋調(diào)節(jié)P16INK4A的結(jié)果。目前國內(nèi)外無P16INK4A高表達對宮頸癌直接影響及機制的文獻報道。最近，Burd等［5］用螢光素酶基因敲入小鼠模型P16(LUC)觀察發(fā)現(xiàn)，在腫瘤形成和間質(zhì)細胞圍繞時P16INK4A的激活非常明顯，提示P16INK4A的激活是腫瘤形成的一種特征。已有文獻［6～10］報道，在某些腫瘤中，P16INK4A作為β-catenin、RhoC等的靶基因參與EMT的調(diào)控，P16INK4A過表達與Twist1啟動子過甲基化存在相關(guān)性，這些研究結(jié)果都間接提示P16INK4A在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，P16INK4A高表達的其中一個原因可能是P16 exon1在宮頸癌組織中擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)較癌旁正常組織明顯增加而引起［11］。本實驗中免疫組化結(jié)果顯示，P16INK4A不僅在CIN及宮頸癌組織的細胞質(zhì)高表達，在細胞核中亦高表達，且P16INK4A與Vimentin核表達呈正相關(guān)，P16INK4A在CIN和宮頸癌組織中的表達明顯高于慢性子宮頸炎組織，提示P16INK4A參與宮頸癌EMT并發(fā)揮重要作用。

Smad4是腫瘤抑制基因DPC4的產(chǎn)物，在多種腫瘤中都有表達。TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路在腫瘤中具有重要地位，但Smad在宮頸癌進展中的具體定位和作用尚不清楚。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)，Smad4蛋白在慢性子宮頸炎組織中細胞核與細胞質(zhì)均為高表達，Smad4細胞質(zhì)表達水平在不同宮頸病變中無明顯差異，細胞核中Smad4在低級別CIN、高級別CIN和宮頸癌組織中表達逐漸降低，表達定位結(jié)果與張琰等［12］報道相似。本實驗中Smad4核表達與Vimentin核表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示進入細胞核的Smad4表達下降可能是引起宮頸癌細胞EMT的原因之一，與薜慧婷等［13］報道低表達 Smad4可抑制SMMC-7721肝癌細胞EMT的結(jié)果相反。Smad4核表達降低使TGF-β誘導(dǎo)的細胞生長抑制反應(yīng)性減弱，可能促進腫瘤的生長和惡性轉(zhuǎn)化［14～16］，宮頸癌患者無病生存期縮短及5年總生存率下降［17］。國外研究報道［18］抑制Cdk4/6可誘導(dǎo)胰腺癌細胞出現(xiàn)EMT，并增加胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，是通過Smad依賴的TGF-β途徑進行。我們前期研究［19］通過免疫共沉淀和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中過度表達的P16INK4A仍然具有結(jié)合Cdk4的能力。結(jié)合本實驗Spearman相關(guān)分析結(jié)果，120例宮頸病變組織中Smad4核表達與P16INK4A核質(zhì)表達均呈負相關(guān)，提示P16INK4A可能通過結(jié)合Cdk4并抑制其活性，協(xié)同或影響Smad4核表達參與宮頸癌發(fā)生EMT，其效應(yīng)途徑有待進一步通過分子生物學(xué)研究證實。

綜上所述，Vimentin核表達增強是診斷宮頸癌細胞EMT的有效指標。P16INK4A高表達和Smad4核表達下降參與了宮頸癌細胞 EMT。進一步研究P16INK4A高表達在宮頸癌中調(diào)控的分子機制，有利于探討宮頸癌細胞EMT的形成，為宮頸癌治療性疫苗的新靶點研制提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

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