結直腸癌組織中MAGE基因啟動子去甲基化狀態與其mRNA表達的關系

嚴茂軍，周懷愉，夏 輝

（1臨沂市腫瘤醫院，山東 臨沂 276001;2山東大學基礎學院）

黑色素瘤抗原（MAGE）基因編碼的抗原肽能夠被自體細胞毒T淋巴細胞識別并殺滅，達到消除腫瘤細胞的目的，是腫瘤免疫治療理想的靶抗原［1］。有研究發現，MAGE基因亞家族在多種惡性腫瘤組織中低表達限制了其抗原作為腫瘤免疫治療靶點的價值，而其啟動子去甲基化可使MAGE基因重新激活表達［2，3］，故應用甲基化抑制劑可提高其表達和臨床應用價值。為探討MAGE基因啟動子去甲基化對其基因表達的影響，我們應用RT-PCR、甲基化特異性PCR（MSP）檢測了結直腸癌組織中MAGE基因mRNA表達及其去甲基化狀態，旨在為以此為靶抗原的免疫治療提供理論依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇臨沂市腫瘤醫院2005年7～11月手術切除、經術后病理證實的原發性結直腸腺癌及相鄰正常黏膜（距腫瘤邊緣＞10 cm）組織標本各65份。其中患者男44例、女21例，年齡30～78歲、中位年齡55.0歲;結腸癌27例，直腸癌38例;TNM分期:Ⅰ期8例，Ⅱ期32例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9例;有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移47例;所有患者未合并肝肺轉移。術前均未行放化療和免疫治療，術后均行FOLFOX4方案化療10～12個周期。

1.2 方法

1.2.1 MAGE-1、MAGE-3 基因啟動子 mRNA 檢測標本切除后即刻放入液氮冷卻，后轉存于-70℃冰箱。Trizol法提取組織總RNA（Invitrogen，美國），MAGE-1、MAGE-3基因擴增條件及引物參照文獻［4］，GAPDH作內參照。以睪丸組織作為陽性對照研究。

1.2.2 MAGE-1、MAGE-3 基因啟動子去甲基化檢測 MSP方法檢測各組織DNA去甲基化。DNA離心柱式抽提試劑盒（江蘇海門市碧云天生物技術研究所）提取各組織DNA，EZ DNA甲基化試劑盒-Gold（D5005）（ZYMO RESEARCH，美國）檢測各組織去甲基化狀態。按試劑盒說明進行操作。MAGE-1、MAGE-3基因啟動子去甲基化引物序列參照文獻［5］。MAGE-1基因啟動子去甲基化引物（U）:上游引物:5＇-TGTTAGGAAATATTTGGGTGTTTG-3＇，下游引物:5＇-AACATCTTCCCACAAATAAACC-3＇，擴增長度246 bp;甲基化引物（M）:上游引物:5＇-CGTTAGGAAATATTCGGGTGTTC-3＇，下 游 引 物:5＇-ACGTCTTCCCGCGAATAAAC-3＇，擴增長度 245 bp。MAGE-3基因啟動子去甲基化引物（U）:上游引物:5＇-TGTTTGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3＇，下 游 引物:5＇-CCATCACTCATTACTCAAAACAAA-3＇;甲基化引物（M）:上游引物:5＇-TTTGTTCGGAATTTAGGGTAGTATC-3＇，下 游 引 物:5＇-GTCGCTCGTTACTCAAAACG-3＇，擴增長度均為 104 bp。修飾后以DNA為模板進行PCR擴增，25 μL反應體系:樣品DNA 2 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，引物各 1 μL，dNTP 2 μL，TaqE 0.2 μL，雙蒸水 16.3 μL。退火溫度50 ℃（M）、50～51.5 ℃（U）30 s，35個循環。甲基轉移酶處理和未處理的人外周血細胞DNA作為陽性和陰性對照。凝膠電泳分離擴增產物，自動成像儀成像分析。判斷標準:僅出現甲基化條帶為高甲基化，同時出現甲基化和非甲基化條帶為半甲基化，僅出現非甲基化條帶為非甲基化，高甲基化與半甲基化均計為甲基化陽性。實驗重復3次。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件，計數資料以百分數表示，比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MAGE-1、MAGE-3 基因啟動子 mRNA 表達65份結直腸癌組織中MAGE-1、MAGE-3 mRNA表達率分別為 18.5%（12/65）、33.9%（22/65），53.8%（35/65）的標本至少表達一種抗原基因;相鄰正常黏膜組織未見表達。

2.2 MAGE-1、MAGE-3基因啟動子去甲基化狀態65份正常黏膜組織中MAGE-1、MAGE-3基因啟動子甲基化率均為100%，但分別有1.5%（1/65）和4.6%（3/65）正常黏膜出現去甲基化;而結直腸癌組織中MAGE-1基因啟動子去甲基化率為29.2%（19/65），MAGE-3基因啟動子去甲基化率為47.7%（31/65）。61.5%（40/65）的標本至少一種基因存在去甲基化。

2.3 MAGE-1、MAGE-3基因啟動子去甲基化狀態與其mRNA表達的關系 65份結直腸癌組織按去甲基化有無分為去甲基化組和甲基化組。MAGE-1去甲基化組mRNA表達率為57.9%（11/19），高于甲基化組的2.2%（1/46）;其去甲基化與mRNA表達相關（χ2=24.155，P＜0.05）。MAGE-3 去甲基化組 mRNA表達率為64.5%（20/31），高于甲基化組的4.3%（2/46）;其去甲基化與mRNA 表達相關（χ2=24.899，P＜0.05）。見表1。

表1 MAGE-1、MAGE-3基因啟動子去甲基化與其mRNA表達的關系

3 討論

DNA甲基化可使RNA聚合酶Ⅱ轉錄的基因表達沉默，是抑癌基因失表達導致腫瘤發生的重要機制［6，7］。作為癌/睪丸抗原（CTA）家族的 MAGE 基因特異性表達于除睪丸和卵巢組織以外的各種腫瘤組織，其編碼的腫瘤特異性抗原多肽能夠被自體細胞毒T淋巴細胞識別，增強對腫瘤細胞的殺傷能力，成為腫瘤免疫治療的理想靶分子［8］，但尚未發現結直腸癌特異性較好的靶點。

MAGE-1、MAGE-3基因是具有CTA基因家族共同特性的腫瘤特異性抗原，其表達與腫瘤的發生、轉移及惡化相關，在不同的腫瘤組織中表達率也各不相同。胃癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤組織中MAGE基因表達率較高，而其表達率的高低可能直接影響到免疫治療的效果［1］。同一種腫瘤常有多種MAGE基因亞家族的表達。如劉芳芳等［9］報道，結直腸癌組織中 MAGE-1、MAGE-3基因的表達率分別為5%、52%，并認為MAGE-3基因有可能成為結直腸癌免疫治療的候選靶點。

已有研究表明，MAGE基因與癌基因以同樣的方式通過去甲基化而重新表達［10］。Yanagawa等［11］研究發現，67例肺癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因表達率分別為29.9%、38.8%，去甲基化率分別為41.8%、46.3%，其中20例 MAGE-1表達陽性組織中18例檢測到去甲基化，而26例MAGE-3表達陽性組織中24例檢測到去甲基化。因此，MAGE基因表達與啟動子去甲基化密切相關，且去甲基化患者較甲基化患者預后差。檢測肝癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因去甲基化狀態也得出了相似的結果，故其對肝癌的早期診斷具有較高的靈敏性和特異性［4］。本研究發現，19份結直腸癌MAGE-1基因去甲基化者11例檢測到基因表達，31份結直腸癌MAGE-3基因去甲基化者20例檢測到基因表達，并且其基因表達與啟動子去甲基化密切相關。提示與其他類型腫瘤相似，結直腸癌組織中 MAGE-1、MAGE-3基因啟動子去甲基化可能是基因重新激活表達的重要調節機制，可發生在腫瘤的早期、進展過程中，具有較高的腫瘤特異性，檢測其甲基化模式有可能對腫瘤的早期診斷、療效觀察和預后判斷提供有價值的信息。但并不是所有去甲基化的腫瘤組織均有基因表達。Kim等［12］觀察32株結直腸癌細胞發現，MAGE-1、MAGE-3分別有59%、66%的表達，而檢測到81%的細胞株出現去甲基化;87例正常黏膜組織中MAGE-1、MAGE-3均出現甲基化，但同時也發現2例和5例擴增出去甲基化條帶。本研究也發現，正常黏膜組織MAGE-1、MAGE-3分別有1、3例出現去甲基化。推測可能有其他機制參與了基因表達的調節。Moreno-Bost等［2］認為，不僅 DNA甲基化，可能還有其他機制參與了MAGE基因表達的調節，如組蛋白修飾、miRNA。正常黏膜組織存在MAGE基因異常去甲基化，說明甲基化改變是結直腸癌發生的一個早期、頻發的事件。

綜上所述，結直腸癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因啟動子去甲基化可能是基因重新激活表達的重要調節機制，是結直腸癌發生的一個早期、頻發的事件，檢測甲基化模式可能有助于結直腸癌的早期診斷和預后判斷。結直腸癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因低表達可能限制了其抗原作為腫瘤免疫治療靶點的價值，應用甲基化抑制劑可顯著提高其表達和臨床應用價值［2］。但結直腸癌組織中有無特異的低甲基化位點、甲基化與轉錄表達的確切機制及對判斷預后的價值還不清楚，需要進一步的研究和探討。

［1］Bao L，Dunham K，Lucas K.MAGE-A1，MAGE-A3，and NYESO-1 can be upregulated on neuroblastoma cells to facilitate cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor cell killing［J］.Cancer Immunol Immunother，2011，60（9）:1299-1307.

［2］Moreno-Bost A，Szmania S，Stone K，et al.Epigenetic modulation of MAGE-A3 antigen expression in multiple myeloma following treatment with the demethylation agent 5-azacitidine and the histone deacetlyase inhibitor MGCD0103［J］.Cytotherapy，2011，13（5）:618-628.

［3］Kim R，Kulkarni P，Hannenhalli S.Derepression of cancer/testis antigens in cancer is associated with distinct patterns of DNA hypomethylation［J］.BMC Cancer，2013，13:144.

［4］LI M，Yuan YH，Han Y，et al.Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue［J］.Clin Cancer Res，2005，11（5）:1809-1814.

［5］Qiu G，Fang J，He Y.5＇CpG island methylation analysis identifies the MAGE-A1 and MAGE-A3 genes as potential markers of HCC［J］.Clin Biochem，2006，39（3）:259-266.

［6］Guo C，Ren F，Wang D，et al.RUNX3 is inactivated by promoter hypermethylation in malignant transformation of ovarian endometriosis［J］.Oncol Rep，2014，32（6）:2580-2588.

［7］Nikolaidis G，Raji OY，Markopoulou S，et al.DNA methylation biomarkers offer improved diagnostic efficiency in lung cancer［J］.Cancer Res，2012，72（22）:5692-5701.

［8］Batchu RB，Gruzdyn O，Potti RB，et al.MAGE-A3 with cell-penetrating domain as an efficient therapeutic cancer vaccine［J］.JAMA Surg，2014，149（5）:451-457.

［9］劉芳芳，葉穎江，王杉.多種MAGE基因在結直腸癌中的表達和意義［J］.中普通外科雜志，2010，25（2）:126-129.

［10］Moreno-Bost A，Szmania S，Stone K，et al.Epigenetic modulation of MAGE-A3 antigen expression in multiple myeloma following treatment with the demethylation agent 5-azacitidine and the histone deacetlyase inhibitor MGCD0103［J］.Cytotherapy，2011，13（5）:618-628.

［11］Yanagawa N，Tamura G，Oizumi H，et al.MAGE expressions mediated by demethylation of MAGE promoters induce progression of non-small cell lung cancer［J］.Anticancer Res，2011，31（1）:171-175.

［12］Kim KH，Choi JS，Kim IJ，et al.Promoter hypomethylation and reactivation of MAGE-A1 and MAGE-A3 genes in colorectal cancer cell lines and cancer tissues［J］.World J Gastroenterol，2006，12（35）:5651-5657.