CD36基因多態性與冠心病患者臨床特征之間的關系

汪自龍，洪 斌，張 政，羅 勇，孫曉臣，羅 溶，王齊兵

(1復旦大學附屬中山醫院青浦分院，上海201700;2復旦大學附屬中山醫院)

冠心病(CAD)是多種因素共同作用的結果，其中脂質代謝紊亂是其發生的最重要危險因素。CD36是體內ox-LDL的受體，也是位于多種免疫細胞表面的B型清除受體，它介導的單核—巨噬細胞系統參與脂質代謝進而影響CAD的發生、發展進程。有研究指出，血清TC和LDL-C水平增加可能與CD36基因突變有關。2009年9月～2012年9月，我們對CD36基因多態性與CAD發生的相關性進行了觀察。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準:符合CAD診斷標準，臨床狀況穩定，無急性冠狀動脈癥狀，1 a內未行血管再通手術或心臟介入治療。排除標準:先天性心臟疾病、有癥狀心力衰竭、心肌病、腎衰竭、甲狀腺功能不全、惡性腫瘤、嚴重感染及自身免疫性疾病患者。收集在復旦大學附屬中山醫院、中山醫院青浦分院、上海松江區中心醫院符合標準的CAD患者120例，男84例，年齡(61.4±13.2)歲;女 36例，年齡(63.8±11.6)歲。本研究獲得醫院倫理審查委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集及檢測方法 收集研究對象的基本臨床資料，包括身高、體質量，計算BMI;記錄高血壓、糖尿病、腦卒中等病史。空腹狀態下取肘部抽靜脈血6 mL，其中3 mL促凝離心后取上清液，-80℃保存。分離血細胞目標基因組DNA，具體步驟參考AxyPrep血液全基因組DNA小量提取試劑盒說明書［4］;PCR擴增后采用變性高效液相色譜(DHPLC)技術，研究包含內含子片段的外顯子4和5的擴增產物［5］，檢測PCR產物的變化;使用Applied Biosystems公司的染料終止子循環測序反應，對其進行雙向測序;使用373A DNA片段分析儀進行半自動序列分析(Applied Biosystems，Foster City，美國)。另外3 mL靜脈血進行血常規、血糖、高敏C反應蛋白(hs-CRP)、血脂、脂蛋白 a［Lp(a)］、載脂蛋白 A1(Apo A1)、載脂蛋白B(Apo B)等檢測。

1.2.2 統計學方法 評估Hardy-Weinberg平衡下基因型分布的一致性，然后根據CD36基因型的不同將病例分組研究;采用SPSS16.0統計軟件，使用Mann-Whitney U檢驗對兩組數據計量資料進行比較分析，使用Fisher精確檢驗對計數資料進行比較，分析基因型和定性變量間是否相關。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD36基因多態性分析結果 DHPLC檢測到CD36基因變異主要包括內含子中2個單核苷酸替換(多態性)，分別為IVS3-6 T/C(rs3173798)和IVS4-10 G/A(rs3211892)，見圖1、2。IVS3-6 T/C 基因型頻率 TT 81.1%、TC 18.9%，次要等位基因頻率9.4%;IVS4-10 G/A 基因型頻率 GG 92.2%、GA 7.8%，次要等位基因頻率3.9%。外顯子中并未發現序列改變。兩種序列變異在Hardy-Weinberg平衡下基因型分布一致(P=1)。證實選取的樣本基因型可以穩定遺傳，可以代表整個群體。

圖1 CD36基因IVS3-6 T/C PCR產物AIwNI酶切圖譜

圖2 CD36基因IVS4-10 G/A PCR產物Hincll酶切圖譜

2.2 CD36基因型多態性與CAD患者臨床數據的相關性 TT型和GG型基因分別占75.8%、74.2%，CD36基因型多態性與CAD患者性別、體質量、BMI、腰臀比、血糖、紅細胞、血小板、高血壓病史、治療方法等不相關，其他臨床資料與CD36基因多態性的關系見表1。

表1 CD36基因型多態性與CAD患者臨床資料的關系

3 討論

基因層面的研究不僅可以幫助我們了解CAD的發病機制，為其治療提供可行的依據［6］;而且，也可為CAD診斷提供方便可行的分子標記，對易發生CAD人群進行早期識別和一級預防。目前，研究人員已經發現大量與CAD相關的單核苷酸多態性(SNP)位點［7］。本研究發現，CD36待測外顯子相鄰的內含子片段中有IVS3-6T/C和IVS4-10 G/A兩種多態性。在中國人群中，IVS3-6C等位基因頻率(24.2%)與NCBI dbSNP數據庫先前報道相似 (16.2%～31.2%);但IVS4-10A等位基因頻率(25.8%)比dbSNP數據庫記錄稍高(11.6%～22.6%)。迄今為止，已明確的與CAD發生相關的危險因素有高血壓、吸煙、高LDL-C血癥、年齡、性別、冠心病家族史、低HDL-C血癥等［8］。本研究結果發現，與 IVS3-6 TT型相比，IVS3-6 TC雜合子CAD患者的血壓較低，存在統計學差異，BMI稍高，肥胖病例更多，但無統計學差異。IVS3-6 TC和IVS4-10 GA基因型與心肌梗死發病年齡之間存在相關趨勢，但趨勢相反:TC雜合子首次心肌梗死年齡更小，GA雜合子年齡更大。目前，很少有研究對亞州人中CD36多態性與體格參數或hs-CRP 水平之間關系進行詳細的分析［9］。Leprêtre等［10］指出，在歐美等人種中IVS4-10 G/A變異與脂聯素水平之間有相關性。Love-Gregory等［11］在對有高血壓病史的非裔美國人的研究中發現，CD36序列變異與體型各參數(BMI≥30 kg/m2，腰圍 ＞100 cm)相關。此外，已經證實白種人rs1527479 CD36啟動子多態性與胰島素抗性和2型糖尿病有關。但本研究發現CD36變異體與2型糖尿病的發病無關，而IVS3-6 TC雜合子比野生型純合子患者更常出現2型糖尿病，各組間空腹血糖并無差異;分析原因，可能是多數TC雜合子的糖尿病患者口服降糖藥或皮下使用胰島素。IVS4-10 GA雜合子患者中2型糖尿病的發病率與野生型沒有差別，與Rac'等［12］結果相似。最新的研究還提出，非裔美國人的一些存在于啟動子(rs10499859、rs109654)和內含子(rs1358337)的CD36多態性可能會導致血漿HDL濃度增加［13］。還有人認為，在 St.Thomas UK成人雙生子登記隊列中，CD36啟動子多態性rs2151916與LDL水平有關，次要等位基因純合子患者LDL-C水平更低［14］。但這些試驗并未分析 IVS3-6 T/C和IVS4-10 G/A 的多態性。Teupser等［14］報道，白種人中兩種多態性(rs1984112、rs1761667)與轉錄起始位點(外顯子1A和1B)的選擇有關，內含子11中的一種多態性(rs1527483)和3'-UTR區(外顯子14和15)的兩種多態性(rs3840546、rs1049673)與血漿游離脂肪酸代謝有關。研究人員將2型糖尿病病例分為CAD陽性和CAD陰性對照，結果提示所有CD36變異均能導致CAD風險增加。本研究中兩種基因型間血清脂質濃度沒有顯著差異;這主要是因為本試驗中多數CAD病例進行定期的心源性監測并服用替他汀類藥物(影響血脂)。另一方面，我們發現IVS3-6 TC基因型與Lp(a)降低有關，這可能也是動脈粥樣硬化疾病(如CAD和中風)的危險因素之一，但這種相關性可能對C等位基因變異體患者有益。非洲人的外顯子10純和無義突變(rs3211938)與Hb提高有關。本研究并未發現不同組間Hb水平存在差異，但觀察到IVS3-6 TC雜合子患者嗜堿性粒細胞比例更少，而IVS4-10 GA雜合子患者的白細胞數量更多，目前尚沒有這種相關性報道，其臨床意義還有待進一步研究。

總之，CD36基因多態性與CAD患者臨床特征存在一定的相關，不同CD36基因型CAD患者的起病機制、臨床特征可能不盡相同。因此，針對不同基因型的CAD患者可以根據其起病的主要危險因素不同，進行有目的治療。

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